[发明专利]一种肝吸虫抗体IgG4生物素-亲和素酶联免疫检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种肝吸虫抗原特异性抗体IgG4检测试剂盒，其特征在于由包被有肝吸虫成虫抗原的酶标条（1），酶标条（1）为96孔微孔板，浓度为1μg/孔；

生物素标记的抗人IgG4特异性单克隆抗体（2），100μL×1瓶，工作浓度为1︰5000稀释；

辣根过氧化物酶标记的链亲和素（3），100μL×1瓶，工作浓度为1︰5000稀释；

显色液A（4），5mL×1瓶，市售品；

显色液B（5），5mL×1瓶，市售品；

肝吸虫抗体IgG4阳性对照品（6），100μL×1瓶，抗肝吸虫的抗体IgG，浓度为1μg/mL；

肝吸虫抗体IgG4阴性对照品（7），100μL×1瓶，纯化的健康人IgG，浓度为1μg/mL；

样品稀释液（8），12mL×1瓶，含2%BSA的PBST；

抗体稀释液（9），25mL×1瓶，含2%BSA的PBST；

浓缩洗涤液（10），50mL×1瓶，工作浓度为1︰20稀释；

反应终止液（11），6mL×1瓶，2M H₂SO₄；

和外包装盒与说明书（12）组成；

所述肝吸虫成虫抗原的制备：将肝吸虫虫体用生理盐水反复洗涤数次，洗尽肝吸虫虫体表面的附着物，直到洗涤液完全变澄清；用玻璃匀浆器在冰上将洗涤后肝吸虫虫体匀浆，加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟PMSF至终浓度为1mM，置于-80℃冰箱，反复冻融后超声破碎后，4℃条件下高速离心，上清液即为肝吸虫成虫可溶性抗原，分装后于- 80℃保存备用；

包被有肝吸虫成虫抗原的酶标条（1）的制备：用pH9.6碳酸缓冲包被液将肝吸虫成虫抗原稀释成0.5-10μg/mL的溶液，按每孔100μL的量包被酶标条，4℃放置过夜后，将酶标条孔的包被液倒出，用稀释洗涤液洗板三次，再用牛血清白蛋白封闭液进行封闭2h，倒去封闭液后用稀释洗涤液洗板三次，真空抽干，4℃储存备用；

生物素标记的抗人IgG4特异性单克隆抗体（2）的制备：

（a）将分泌抗人IgG4单克隆杂交瘤细胞注射到小鼠体内，产生腹水；

（b）收集腹水，采用Protean A亲和层析法纯化抗人IgG4特异性单克隆抗体；

（c）将单克隆抗体与活化的生物素混合进行标记，透析去除未结合的生物素，得到生物素标记的抗人IgG4特异性单克隆抗体；

辣根过氧化物酶标记的链亲和素（3）的制备：

（d）辣根过氧化物酶HRP在过碘酸钠NaIO₄作用下，使HRP分子上的糖基氧化成醛基，透析去除化学试剂；

（e）加链亲和素Streptavidin，HRP醛基与链亲和素的氨基共价结合，形成Streptavidin-HRP结合物；

显色液A（4）为市售品；

显色液B（5）为市售品； 

肝吸虫抗体IgG4阳性对照品（6），由纯化的粪检虫卵阳性的肝吸虫病人抗体IgG配制而成，用本试剂盒进行检测其OD450nm吸光值大于0.5；

肝吸虫抗体IgG4阴性对照品（7）：由纯化的粪检确定为非肝吸虫感染的健康人群抗体IgG配制而成，使用本试剂盒进行检测其OD450nm吸光值小于0.1；

样品稀释液（8）为含有牛血清白蛋白、Tween-20的磷酸缓冲液；

抗体稀释液（9）为含有牛血清白蛋白、Tween-20的磷酸缓冲液；

浓缩洗涤液（10）为含Tween-20的磷酸缓冲液；

反应终止液（11）为硫酸。

2.用权利要求1所述肝吸虫抗原特异性抗体IgG4检测试剂盒检测肝吸虫抗体IgG4的方法，其特征在于步骤为：

（1）试剂盒在室温平衡30min，浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水进行20倍稀释，得稀释洗涤液；

（2）取所需要使用的孔数的酶标条，包括样本检测孔，阳性对照孔，阴性对照孔，空白孔，每次检测设阳性对照孔一个，阴性对照孔一个，空白孔二个，剩余的酶标条放入密封袋中保存；

（3）将酶标条固定于板架上，检测孔加入100μL样品稀释液，再加入1μL待检测样品血清或直接加入1︰100稀释的血清样本，对照孔分别直接加入相应的对照样本，在37℃温箱温育45min；

（4）甩尽孔中液体，加入稀释洗涤液到满孔350μL，震荡30s后室温静置30s，甩干后，再加入稀释洗涤液洗涤，如此重复5次；

（5）各孔加入100μL用抗体稀释液按1:5000稀释的生物素标记的抗人IgG4单克隆抗体，在37℃温箱温育45min；

（6）用稀释洗涤液洗板5次后，加入100μL用抗体稀释液按1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的链亲和素，在37℃温箱温育45min；

（7）用稀释洗涤液洗板5次后，吸干各孔残留液体，将显色液A、B液等体积混匀后，各孔均加入A、B混合显色液50μL，室温避光显色5 min，各孔加入终止液50μL，轻微振荡混匀；

（8）结果判断：以空白对照孔调零，用酶标仪测定各孔450nm的吸光值，

判读前所有对照与样本孔的A450nm值均应减去空白对照孔的A450nm值；

阳性：样本孔的A450nm值≥阴性对照孔A450nm值的2.1倍，肝吸虫抗体IgG4阳性；

阴性：样本孔的A450nm值≤阴性对照孔A450nm值的2.1倍，肝吸虫抗体IgG4阴性。