[发明专利]盐生杜氏藻培养基配方及四级培养技术

说明书

技术领域  本发明属于海洋微藻养殖领域，尤其涉及一种盐生杜氏藻培养基配方及四级培养技术。

背景技术

盐生杜氏藻(Dunaliella salina)是一种双鞭毛单细胞真核生物，可耐高盐度(20-300‰)。杜氏藻在胁迫条件下可大量积累β-胡萝卜素，最高可达干重的8-14％，为自然界所有生物之首，因此早在1966年，Massyuk就提出可大规模培养杜氏藻生产β-胡萝卜素；另外杜氏藻含有的甘油可达干重的40％，具有生产甘油的潜在前途；杜氏藻还是水产养殖动物(对虾、扇贝、鲍鱼等)良好的单细胞蛋白饲料。美国、澳大利亚、以色列、日本等很早就开始了杜氏藻的研究，并已经投入工业化养殖。我国拥有漫长的海岸线(18000Km)和众多的内陆盐湖，具有养殖杜氏藻生产β-胡萝卜素优越的自然条件。本发明给出了盐生杜氏藻培养的最适营养盐配方，可提高杜氏藻产量、促进盐生杜氏藻大量积累β-胡萝卜素并降低养殖成本。氮、磷盐种类、浓度及其比例、温度、光照、盐度等对杜氏藻生长和β-胡萝卜素的合成都有重要影响。氮在细胞代谢中是形成氨基酸、嘌呤、嘧啶、卟啉、氨基糖和胺化合物等的基本元素，因而氮是杜氏藻生长最重要的营养元素。

海水中无机碳的存在形式以HCO₃^-为主(90％)，而游离的CO₂不足1％。过去人们一直认为，水体中游离CO₂是藻类利用外源无机碳的唯一形式。张学成的工作表明，螺旋藻培养基中添加50～100mmol/dm³NaHCO₃时，不仅可以满足螺旋藻生长的需要，而且有助于保持藻体生长的pH值。林惠民认为，NaHCO₃在培养基中的作用之一是作为营养的碳源。我的研究结果表明，培养过程的前5天，NaHCO₃含量急剧减少与杜氏藻的快速生长是相吻合的，说明杜氏藻可以利用HCO₃^-作为碳源。

目前，盐生杜氏藻规模化培养存在的主要问题是藻细胞生长缓慢、倍增时间长、易污染。合适的培养基是实现盐生杜氏藻高密度培养的重要因素之一。以前使用的培养基没有加入碳酸氢钠和生物素，但大量实验表明，盐生杜氏藻除了能利用空气中游离的CO₂，还能有效地利用培养液中的HCO₃^-作为碳源。添加NaHCO₃不仅缩短了盐生杜氏藻的倍增时间，而且延长了盐生杜氏藻的生长时间。我的实验表明，添加504mg/L的NaHCO₃和1×10^-3mg/L的生物素能大大提高生长速度，盐生杜氏藻的产量能提高44％。

总之，使用优化培养基并采用四级培养方法培养盐生杜氏藻具有生长速度快、产量高、β-胡萝卜素含量高、成本低、易于操作、不易污染的优势。

发明内容  为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种盐生杜氏藻培养基配方及制备方法，具体技术方案如下：一种盐生杜氏藻培养基，配方如下：NH₄NO₃20mg、尿素15mg、KH₂PO₄13.6mg、NaHCO₃504mg、柠檬酸铁16.75mg、维生素B₁2×10^-4mg、维生素B₁₂8×10^-4mg、生物素1×10^-3mg、消毒海水1000mL。

一种盐生杜氏藻培养基，其特征在于该盐生杜氏藻培养基配方如下：NH₄NO₃20mg、CO(NH₂)₂(尿素)15mg、KH₂PO₄13.6mg、NaHCO₃504mg、FeC₆H₅O₇·5H₂O(柠檬酸铁)16.75mg、维生素B₁2×10^-4mg、维生素B₁₂8×10^-4mg、VB₆ 0.1mg、生物素1×10^-3mg、ZnSO₄500mg、体积比1％的钼酸水溶液15ml、硫酸锰5mg、磷酸二氢钾10mg、氯化钾3mg以及海水1000mL。