[发明专利]一种高效液相色谱梯度法测定左亚叶酸钙有关物质的方法

权利要求书

1.一种高效液相谱梯度法检测左亚叶酸钙待测样品中有关物质的方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：

(1)制备标准品溶液，以所述标准品溶液在下述色谱条件下进行系统适用性试验，校定检测系统；

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶(250×4.0mm，5μm)为填充剂，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以磷酸盐缓冲液-甲醇(40∶60)为流动相B，梯度洗脱，柱温为35～40℃，流速为0.9～1.1ml/min，检测波长为280nm；

标准品溶液制备：分别取杂质A、C、D、G及左亚叶酸钙标准品，精密称定，加水制成每1ml溶液中分别含杂质A、C、D、G及左亚叶酸钙各0.005～0.01mg的混合溶液，精密量取10μl所述混合溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，校定检测系统至左亚叶酸钙主峰与相邻杂质G的峰的分离度应大于1.5，理论板数按左亚叶酸钙峰计算应不低于5000；

其中，所述A是(2S)-2-[(4-氨基苯甲酰)氨基]戊二酸，C是(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4-二氢-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸，D是(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4-二氢-6-蝶啶基)甲基]甲酰氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸，G是(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4，7，8-四氢-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸。

(2)制备供试品溶液和对照溶液

取左亚叶酸钙待测样品，加水制成浓度为1mg/ml的溶液，作为供试品溶液；

量取所述供试品溶液，加水制成浓度为0.01mg/ml的溶液，作为对照溶液；

(3)通过高效液相色谱测定待测样品中的相关物质的含量

以对照溶液注入经上述步骤(1)校定后的液相色谱仪，调节检测灵敏度，再将供试品溶液注入液相色谱仪，在步骤(1)所述的色谱条件下进行高效液相色谱测定，记录色谱图至左亚叶酸钙主峰保留时间的2.5倍，其中供试品溶液色谱中各杂质峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积的2倍；

(4)计算待测样品中各杂质的含量。

2.权利要求1所述的方法，其中所述的梯度洗脱中，流动相A比例的变化范围为于0～20分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从90％变化为66％，流动相B的比例从10％变化为34％；于20～42分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持66％不变，流动相B的比例保持34％不变；于42～43分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从66％变化为90％，流动相B的比例从34％变化为10％；于43～50分钟，流动相A和B回到初始比例，色谱柱重新平衡。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵的一种或多种。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述磷酸盐缓冲液包括0.01mol/L磷酸氢二钠、0.08％四丁基氢氧化铵，pH值为7.8～8.0。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶(250×4.0mm，5μm)为填充剂，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以磷酸盐缓冲液-甲醇(40∶60)为流动相B，梯度洗脱，柱温为40℃，流速为1.0ml/min，检测波长为280nm。

6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述左亚叶酸钙待测样品包括左亚叶酸钙原料、左亚叶酸钙中间体、注射用左亚叶酸钙和左亚叶酸钙注射液。