[发明专利]基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种基于Taqman-ARMS技术检基因突变位分型的方法。

背景技术

目前普遍应用的基因突变检测方法为限制小片段长度多态性分析法（RFLP法）和DNA直接测序等。RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法，但是该方法存在以下缺点：RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性，非闭管操作，易于污染，难以满足临床检测要求。DNA直接测序为突变检测的金标准。该方法存在以下缺点检测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高。DNA直接测序的灵敏度较低，杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据，需要多次重复测序才可能避免假阳性等，因此直接测序方法难适用于临床检测。

因此，急需开发一种快速、准确、操作简便和避免交叉污染的基因突变检测技术，满足基因突变分型的时效性要求。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法，解决了现有技术中进行基因突变分型程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度低等问题。

为实现上述发明目的，技术方案为：

基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法，包括以下步骤：

（1）根据目的基因的突变位点设计ARMS引物，所述ARMS引物的上游引物或下游引物的3’末端为突变位点，并将位于突变位点上游第1-3位核苷酸中的任一位错义突变；

（2）根据所述突变位点设计Taqman-MGB探针，所述Taqman-MGB探针特异识别ARMS引物的扩增产物正义链突变位点的Taqman探针，所述探针的3’端结合有小沟结合分子；

（3）提取模版DNA，利用步骤（1）所得引物对和步骤（2）所得探针对模板DNA进行荧光定量PCR检测。

优选的，将所述突变位点上游第1位核苷酸中的错义突变。 

优选的，所述步骤（1）中，所述突变位点为EGFR基因2573位错义突变，所述ARMS引物为SEQ ID No：3和SEQ ID No：5所示的核苷酸序列。

优选的，所述步骤（2）中，所述Taqman-MGB探针为SEQ ID No：9所示的核苷酸序列。

本发明目的之二在于提供上述检测方法使用的试剂盒，其使用方便，灵敏度高，技术方案为：

所述试剂盒包括检测目的基因的突变位点的ARMS引物和Taqman-MGB探针，所述ARMS引物的上游引物或下游引物的3’末端为突变位点，并将位于突变位点上游第1-3位核苷酸中的任一位错义突变；

所述Taqman-MGB探针为特异识别ARMS引物的扩增产物正义链突变位点的Taqman探针，所述探针的3’端结合有小沟结合分子。

优选的，所述ARMS引物为SEQ ID No：3和SEQ ID No：5所示的核苷酸序列。

优选的，所述Taqman-MGB探针为SEQ ID No：9所示的核苷酸序列。

优选的，所述试剂盒由PCR 缓冲液、dNTPs、引物对、Taqman-MGB探针、MgCl₂、TaqDNA聚合酶和模板DNA组成，各组分反应时终浓度为：