[发明专利]实时荧光定量RT-PCR定量检测南方水稻黑条矮缩病植株中病毒RNA拷贝数

说明书

技术领域：

本发明涉及水稻植株上南方水稻黑条矮缩病毒的检测及病毒RNA拷贝数的准确定量，属于农业科学技术领域。 

背景技术：

南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV)为呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)第2组的一个建议新种。主要由白背飞虱(Sogatella furcifera)以持久性不经卵的方式传播，可侵染水稻、玉米等引起南方水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病。该病毒粒体球状，基因组由10条双链RNA组成。水稻各生育期均能够受到SRBSDV的浸染，田间症状主要表现为植株矮缩、叶色深绿、叶背及茎秆有初期乳白色、后期褐色的瘤状突起，拔节期病株茎节部数节产生倒生的气生须根及高节位分蘖，寄主除水稻外还包括玉米及多种杂草。对水稻的产量影响很大，重病田甚至可导致无产量。近年来该病在长江下游地区蔓延发生，且呈日渐严重的趋势，2009年南方水稻黑条矮缩病毒全国发生面积达300万亩，2010年迅速上升至1900万亩，仅湖南省就发生近1000万亩，绝收面积8万亩，给水稻生产带来了巨大的损失。迫切需要建立可靠、准确的检测方法。 

目前，植物病毒常用的检测方法有：生物学接种实验，血清学检测，电镜观察及分子方法检测。但由于SRBSDV与水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)基因组序列同源性高，在田间症状、病毒粒体形态、大小及血清学等多方面特征非常相似，所以给其诊断及鉴定造成了 困难，而且传统方法存在耗时长、操作复杂及成本高等缺陷，PCR等分子方法的敏感性高，但只能进行半定量或得出“有或无”的结论，不能准确定量病毒RNA拷贝数，使得发病机制及SRBSDV的基础研究等受到了一定的限制。 

Real time RT-PCR是一种简单有效的检测基因拷贝数的方法，实现了PCR从定性到定量的飞跃，可精确地判断病毒RNA的拷贝数，而且具有耗时少，灵敏性高、操作简便、安全经济等优点。SYBR Green I是一种双链DNA染料，与双链DNA结合后荧光强度明显增强，在扩增体系中加入该染料即可直接实时检测扩增产物。该染料没有特异性，不能识别特定的双链，对不同模板不需特别定制，不需要设计特异性很好的探针，通用性比较好。可以通过测定扩增产物的熔解曲线来正确区分特异性与非特异性。利用已知起始拷贝数的标准品做出标准曲线后，只要获得未知样品的循环阈值(threshold cycle，C_T值)，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。拥有常规PCR技术无法比拟的优点：特异性强，通过特异性引物或探针与靶标基因的特异性杂交来完成模板的鉴别，准确性很高，不易出现二聚体等非特异性产物；灵敏度更高，用能够产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，极大地提高了检测的灵敏度；精确性好，可以利用指数期的C_T值精确定量起始模板量，还可以检测到单拷贝基因；快速、简便，扩增和检测在同一管内完成，不需要开盖进行电泳检测，大大减少了操作、缩短了时间，避免了交叉污染、环境污染，有效地解决了PCR污染问题；自动化程度高，将光谱技术于计算机技术结合使用，扩增和检测是同步完成，通过计算机进行实时检测，而且操作系统封闭。实时荧光定量PCR技术正在越来越广泛的应用到科学研究的各个领域。 

发明内容：

本发明提供了一种检测并准确定量水稻病株中南方水稻黑条矮缩病毒的方法，通过该方法可以排除水稻黑条矮缩病毒的干扰，快速诊断出水稻植株中是否携带南方水稻黑条矮缩病毒并得到病毒RNA的拷贝数。 

本发明所提供的一种快速检测并定量水稻植株中南方水稻黑条矮缩病毒的方法，是通过以下方法获得的： 

1)根据NCBI已报道的南方水稻黑条矮缩病毒S9核苷酸序列，通过软件DNAstar分析后选择相对保守区域(尤其是与RBSDV相比)，利用EU523359.1上的对应区域通过Primer5设计引物，选择最佳的2条引物SRBSDV-S9-F和SRBSDV-S9-R； 

2) Reagent(Invitrogen)提取水稻病株总RNA；