[发明专利]透明质酸/明胶/硫酸软骨素骨修复仿生支架的制备方法

说明书

技术领域

 本发明属于生物活性材料领域，涉及软骨组织修复、填充及组织工程修复材料，具体涉及一种透明质酸/明胶/硫酸软骨素骨修复仿生支架的制备方法。

背景技术

关节软骨是人体中较为特殊的一种组织，它没有血管、神经和淋巴细胞，因而自修复能力很差。目前临床上传统的治疗方法主要有微骨折术、软骨下骨钻孔术、软骨下磨削术、自体软骨移植和自体细胞移植术等，但是这些方法存在许多不足，且会给病人带来二次创伤。目前还没有一种方法能够成功的替代损伤部位并达到软骨再生的目的。

软骨组织工程是目前研究最热的一种方法，是将细胞、环境因子、支架材料三者结合，体外模拟细胞生存的最佳微环境，使细胞活性和表型均能与体内情况相似，从而达到修复软骨组织的目的。

在软骨修复中，软骨细胞与基质之间的相互作用至关重要，良好的水凝胶支架材料应提供与天然软骨组织相似的结构和性能。软骨细胞外基质主要由Ⅱ型胶原蛋白和多糖组成。胶原呈网络结构分布于整个软骨基质中，其主要功能是为软骨细胞提供张力和承受力，为软骨细胞的粘附提供基础，并参与软骨细胞表型分化的调节。

在这类软骨组织修复材料中，水凝胶组织工程支架由于与软骨细胞外基质具有相似的特性而受到了广泛的关注。目前制备水凝胶的方法有物理交联法和化学交联法：物理交联法利用分子间氢键作用，离子静电作用或是亲疏水作用等，由于分子间作用力不强，导致物理交联法制备的水凝胶不稳定，容易水解或是熔融；化学交联法制备的水凝胶结构性能稳定，机械强度较好，但是大部分化学反应需要添加各种有毒的引发剂和交联剂。针对这些缺点，近几年出现了利用快速有效无毒的Diels-Alder点击化学反应制备水凝胶软骨组织工程支架的方法。

目前，用于软骨修复水凝胶的材料包括天然生物材料，如：胶原、壳聚糖、透明质酸（简称：HA）、明胶（简称：G）等，和合成高分子材料，如PLGA、PLA、PCL等两大类。合成高分子水凝胶力学性能优异，但是由于缺乏细胞结合位点和生物相容性而限制其在软骨修复上的应用；对于天然生物材料，一般较难形成水凝胶体系，且存在降解速率快和力学性能不能满足需求等缺点。将天然材料与合成材料进行复合可以在改善力学性能的同时提高材料的生物相容性，但是与天然的软骨细胞外基质相比相差甚远。还有一类通过对胶原进行修饰和改性制备水凝胶修复材料的方法，但是胶原分子量大，不容易与其他物质相互键合，除了六氟异丙醇几乎不溶于任何溶剂，而六氟异丙醇毒性强，不适合运用在生物医学材料领域。因此要得到胶原溶液很困难，对胶原进行修饰和改性更是难上加难，致使其并不适合作为一种水凝胶材料。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术的缺点，提供一种透明质酸/明胶/硫酸软骨素骨修复仿生支架的制备方法，并将其应用于软骨关节修复。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

透明质酸/明胶/硫酸软骨素骨修复仿生支架的制备方法，包括如下步骤：

（1）在透明质酸的2-(N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液中，加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐活化剂后搅拌0.5~1h，再逐滴加入糠胺，反应24~48h，透析3~5天，冷冻干燥得到改性透明质酸固体；

（2）在明胶水溶液中加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺搅拌均匀后，加入呋喃甲酸，反应24~48h，透析3~5天，冷冻干燥得到改性明胶固体；

（3）将步骤（1）中得到的改性透明质酸固体和步骤（2）中得到的改性明胶固体共同溶解于2-(N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液中得到混合溶液；

（4）将双端基马来酰亚胺聚乙烯醇溶解于2-(N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液中得到双端基马来酰亚胺聚乙烯醇溶液；

（5）将步骤（4）得到的双端基马来酰亚胺聚乙烯醇溶液加入步骤（3）得到的混合溶液中，搅拌均匀后，在37~50℃水浴中进行点击化学反应直至形成透明的交联水凝胶状态；

（6）将步骤（5）得到的水凝胶浸泡在硫酸软骨素钠盐的2-(N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液中，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺搅拌反应24~48h，得到透明质酸/明胶/硫酸软骨素骨修复仿生支架。

步骤（1）中，所述透明质酸与2-(N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液的质量体积比为0.2~0.8%；所述透明质酸、糠胺与4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐的摩尔比为1:2:（2~6）。