[发明专利]一种嗜热酸性普鲁兰酶的制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种嗜热酸性普鲁兰酶及其制备方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

嗜热细菌是一类可以在55℃以上环境温度中生长繁殖的微生物，根据其最适生长温度的不同，可以分为嗜热菌（55-80℃）和超嗜热菌（80-110℃）。由于具有良好的热稳定性和嗜热性，来源于嗜热细菌的酶被称为嗜热酶。嗜热酶不仅具有高效的反应催化活性，而且在高温下能够保持很高的稳定性，对有机溶剂及变性剂也有很强的抗性，因此是生物催化领域近年来发现重要的新型生物催化剂，广泛应用于食品工业、环境保护、能源以及石油开采等工业生物技术方面。迄今已有嗜热蛋白酶，淀粉酶，木聚糖酶，纤维素酶等嗜热酶投入工业应用，尤其是来源于水生栖热菌Thermus Aquaticus的DNA聚合酶（Taq酶）在PCR技术中的广泛应用，使得该技术在生物研究和医疗领域都实现了新的飞跃。

普鲁兰酶( EC 3. 2. 1. 41) 属于淀粉水解酶，能够专一性水解普鲁兰多糖、糖原、淀粉、支链淀粉和相应低聚糖中 α-1,6糖苷键的脱枝酶。普鲁兰酶与α-淀粉酶、β-淀粉酶或糖化酶共同作用可将淀粉彻底水解为葡萄糖，因此广泛应用于以淀粉为原料的食品深加工、酿造、医药和新生物质能源等工业部门。根据水解的糖苷键差异分为I型( 专一性水解普鲁兰的α-1，6-糖苷键) 和II型(可水解普鲁兰的α-1，6-糖苷键以及其他多聚糖的α-1，4-糖苷键) 两种。

嗜热细菌（Thermotoga lettingae TMO）是一类嗜高温的、无芽孢的严格厌氧菌，其最适生长温度为65℃， 最适pH在7.0左右。T. lettingae能够分解和利用淀粉、纤维素和半纤维素等多聚糖，是嗜热淀粉酶和纤维素酶的理想来源。目前已经有一些嗜热酶从该菌中分离得到，比如：葡聚糖酶，乙醇脱氢酶，肽酶等。这些酶在工业，纺织，食品以及生物工程领域都具有很好的应用前景。

到目前为止，全世界上只有丹麦NOVO和美国杰能科两家公司具备普鲁兰酶工业化生产能力，生产水平在100-400 U/mL（发酵液）。普鲁兰酶对于淀粉支链的水解具有重要作用，然而由于其特殊定位以及复杂的分泌系统，为工业化生产带来障碍。

发明内容

本发明的目的是提供一种嗜热温酸性普鲁兰酶及其制备方法和应用。

本发明的技术方案是：一种嗜热酸性普鲁兰酶的制备方法，它的步骤如下：

（1）设计并合成嗜热酸性普鲁兰酶的引物，引物的序列如下：

上游引物 P1：5′- GGTTATCTCATATGTTCCCTGTACATCACC-3′；

下游引物 P2：5′- GAGCTGCCGTCGACAAGAAATCTTTATTTTTCATC-3′；

（2）PCR扩增及重组质粒的构建： 

以嗜热细菌全基因组序列为模板进行扩增，PCR扩增条件如下：94℃ 预变性5 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证；

（3）基因的诱导表达与蛋白质的纯化：

将重组质粒转化E. coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL，加入0.5-1 mol/L IPTG于37℃继续培养3-5 h，诱导表达的蛋白经过热处理，镍柱亲和层析，得到纯化的酶蛋白。

嗜热酸性普鲁兰酶酶在制备麦芽三糖中的应用。

嗜热酸性普鲁兰酶酶在制备单糖葡萄糖中的应用。