[发明专利]一种转化野生型枯草芽孢杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细菌转化领域，具体的涉及一种转化野生型枯草芽孢杆菌的方法。

背景技术

枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性细菌，广泛存在于自然界中，很多植物内生和土壤习居枯草芽孢杆菌是潜在的植物病害生物防治因子，建立相应转化体系是对菌株进行荧光标记以原位监测其定殖、分布规律的前提。转化是指细菌摄取外界环境中DNA的过程，细菌能够通过自然转化适应复杂的外界环境，转化的发生可能会造成基因克隆、突变体产生和基因图谱等现象。

枯草芽孢杆菌转化机制研究表明，细胞感应外界信号后经过一系列调控途径诱导感受态形成因子ComK的产生，ComK再调控一系列后期感受态形成基因（late competence genes）表达，这些基因编码细胞膜上识别并接受外源DNA的复合体和胞内保护酶等产物，目前所有转化的发生都需要细胞处于感受状态，这样才可能转化成功，因此制备性能良好的感受态细胞是实现枯草芽孢杆菌转化的关键步骤。

传统转化方法很难在实验室条件下实现野生型枯草芽孢杆菌的人工转化，许多已经成功转化的菌株是经过遗传改良或是适应了实验室条件的菌株。对于野生型枯草芽孢杆菌人工转化来说，现有的方法主要是自然转化法、原生质体转化法和传统电击转化法等。自然转化法操作简单，但成功率极低，该方法中的培养基诱导细胞进入感受状态这一步十分关键，加入质粒后发生自然转化的概率很低。原生质体转化法转化率相对较高，但步骤繁琐，加入溶菌酶的量及处理时间、聚乙二醇（PEG）的处理方法及处理时间、细胞壁的再生及转化子筛选等步骤非常关键，很难把握。传统电击转化法使用较多，操作相对简便，但转化效率不高，电压（电容与电阻的设置）和时间常数是关键参数。

发明内容

本发明的目的是提供一种转化野生型枯草芽孢杆菌的方法。

本发明提供的转化野生型枯草芽孢杆菌的方法，包括制备感受态细胞和电击转化两个步骤；

所述制备感受态细胞依次包括如下步骤：

（1）将野生型枯草芽孢杆菌接种至生长培养基，使野生型枯草芽孢杆菌的初始浓度为1.8×10⁷-7.7×10⁷cfu/mL（如1.8×10⁷-5×10⁷CFU/mL或5×10⁷-7.7×10⁷CFU/mL），35-37℃（如35-36℃或36-37℃）振荡培养2-3.5h（如2-3h或3-3.5h）；所述生长培养基的溶剂为水（如双蒸水），溶质及其浓度如下：硫酸铵1.8-2.2g/L（如1.8-2g/L或2-2.2g/L）、磷酸氢二钾14-16g/L（如14-14.8g/L或14.8-16g/L）、柠檬酸三钠1.5-2.5g/L（如1.5-1.9g/L或1.9-2.5g/L）、硫酸镁0.09-0.1g/L（如0.09-0.098g/L或0.098-0.1g/L）、葡萄糖4.8-5.2g/L（如4.8-5g/L或5-5.2g/L）和酪蛋白水解物0.18-0.22g/L（如0.18-0.2g/L或0.2-0.22g/L）；

（2)将1体积份完成步骤(1)的培养体系与0.8-1.2体积份（如0.8-1体积份或1-1.2体积份）诱导培养基混匀，35-37℃（如35-36℃或36-37℃）振荡培养1.5-3.5h（如1.5-3h或3-3.5h）；所述诱导培养基的溶剂为水（如双蒸水），溶质及其浓度如下：硫酸铵1.8-2.2g/L（如1.8-2g/L或2-2.2g/L）、磷酸氢二钾14-16g/L（如14-14.8g/L或14.8-16g/L）、柠檬酸三钠1.5-2.5g/L（如1.5-1.9g/L或1.9-2.5g/L）、硫酸镁0.09-0.1g/L（如0.09-0.098g/L或0.098-0.1g/L）和葡萄糖4.8-5.2g/L（如4.8-5g/L或5-5.2g/L）；

所述电击转化包括如下步骤：将待转化的质粒与所述感受态细胞混匀并冰浴，然后采用1.2-1.8kV（如1.2-1.5kV或1.5-1.8kV）的电压进行电击，得到导入所述待转化质粒的重组枯草芽孢杆菌。