[发明专利]一种从蚯蚓血清中纯化乙酰胆碱酯酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及乙酰胆酯酶的萃取方法，特别涉及一种从蚯蚓血清中纯化乙酰胆碱酯酶的方法。

背景技术

乙酰胆碱酯酶是生物神经传导中的一种关键酶，在神经传导中起着至关重要的功能。该酶降解乙酰胆碱，终止神经递质对于突触后膜兴奋刺激作用，保证神经信号分子在生物体内的正常的传导。乙酰胆碱酯酶上有着有机磷和氨基甲酸酯类化合物的作用位点，当这两类化合物与乙酰胆碱酯酶结合后，就会造成酶催化部位的磷酰化和氨基甲酰化，使其对乙酰胆碱的乙酰化作用无法进行，从而破坏了正常的神经传导作用。酶的失活从而引起生物的中毒，利用这一原理可以起到杀虫的效果。乙酰胆碱酯酶的活性受抑制程度与农药的量呈现线性关系，因而可用AChE的活性受抑制程度来检测果蔬中的残留农药量。因此，高灵敏度、高纯度的乙酰胆碱酯酶批量制备成为酶抑制法研究的重点问题。

乙酰胆碱酯酶的来源很多，动物的肝状，脑部，血液中均存在较丰富的该酶源，有学者分别用猪肝、麦麸、鲫鱼脑、蚯蚓和鸡血来提取乙酰胆碱酯酶，从提取得到酶的活性和大规模操作的方便程度，用蚯蚓为酶源有较大的优势。丁诗华等(应用与环境生物学报，1997,3,246-251)采用Triton X-100蚯蚓血清抽提液经PEG2000-磷酸钾缓冲液处理、离子交换层析及凝胶过滤后，获得电泳纯的胆碱醋酶。但该方法纯化提取过程复杂，纯化倍数低，未实现酯酶的分离。现有《一种从动物血液中提取乙酰胆碱酯酶的制备方法》（专利申请号为02134464）包括如下步骤：将大白鼠、鸡、鸭、牛、狗、黄鳝鱼、鳗鱼的血液于温室下凝固，冷冻、取其上清液，上清液离心分离，得到乙酰胆碱酯酶的粗提取液，用硫酸铵沉淀法纯化，用透析法脱硫酸铵，酶液浓缩干燥，得到纯化的乙酰胆碱酯酶制品。

现有从蚯蚓血清中提取乙酰胆碱酯酶的方法为：丁诗华等(应用与环境生物学报，1997,3,246-251)在蚯蚓血清中加入磷酸钠缓冲溶液充分匀浆，采用Triton X-100抽提液经PEG2000-磷酸钾缓冲液处理、离子交换层析及凝胶过滤后，获得电泳纯的胆碱醋酶。该方法过程复杂，纯化倍数低，未实现酯酶的分离，会减弱酶的活力。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对上述现状，旨在提供一种成本低、操作方便、实用性较强的从蚯蚓血清中纯化乙酰胆碱酯酶的方法。

为解决该技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种从蚯蚓血清中纯化乙酰胆碱酯酶的方法，蚯蚓预处理：将蚯蚓放置清水中24h，排除体内的粪便，将其储存在4℃冰箱中待用；用pH8.0，0.1mol/L的磷酸缓冲溶液，在冰水浴条件下匀浆，制成匀浆液，在4℃下离心(10000r/min)20min得粗酶提取液，保存在冰箱中。100μL粗酶提取液中加入表面活性剂Triton X-114(0.09%,w/v)溶液和0.6mL pH4.1柠檬酸缓冲溶液用二次水定容到10mL充分振荡并摇匀。将其上述溶液放置在水浴温度为35℃恒温水槽中平衡9min，而后将其取出，以4000r/min离心5min，分层后将其上层溶液倾倒，下层即为纯化后乙酰胆碱酯酶制品。

本发明提供的是蚯蚓血清乙酰胆碱酯酶的纯化萃取方法，其酶来源便宜广泛，并且灵敏度高，制备工艺简单稳定，生产成本低。

该方法使用温和的试剂Triton X-114来萃取血清中的乙酰胆碱酯酶，与层析凝胶法相比，对酶的活力无影响，并且能够保持酶的全结构，有利于酶结构研究；再者该方法利用蚯蚓血清中乙酰胆碱酯酶的等电点来实现酶的分离和纯化，能够将其他的蛋白酶和酯酶分离出去，使酶的纯化倍数较高。

Triton X-114是一种非离子型表面活性的，产品名称：Triton X-114/曲拉通X-114，别名：辛基苯基聚氧乙烯醚，4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)cyclohexyl-polyethylene glycol。

附图说明：

图1从蚯蚓血清中提取纯化乙酰胆碱酯酶的流程图。

图2浊点萃取纯化出的乙酰胆碱酯酶经SDS-凝胶电泳图。

1为Marher；2为乙酰胆碱酯酶经纯化后所得到电泳图；3为粗提取的乙酰胆碱酯酶电泳图。

具体实施方式

参见图1，一种从蚯蚓血清中纯化乙酰胆碱酯酶的方法：

1）蚯蚓预处理：将购买的蚯蚓洗净后放入清水中24h，使其排净体内的粪便，储存在4℃冰箱中待用；