[发明专利]一种简单、快速提取柳枝稷组织总RNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及植物的基因克隆、基因功能分析等分子生物学实验，具体涉及一种简单、快速提取植物组织总RNA的方法，适用于植物组织总RNA的提取。

背景技术

随着现代分子生物学的发展及其向各个学科的渗透，越来越多的分子水平技术被应用于植物的研究。如采用转基因技术增强植物的抗逆性，提高光合效率，增加生物学产量等。植物总RNA提取技术是一项植物分子生物学的基本实验技术，也是进行植物分子生物学方面研究的必要前提，对于功能基因组学以及遗传学研究具有重要意义。利用分离得到的纯度高、完整性好的高质量总RNA，才能用于Northern杂交，mRNA纯化、构建cDNA文库，通过RT-PCR分离基因以及进行蛋白质体外翻译等分子生物学实验操作。由于自然界和实验室都存在大量的RNA酶，因此RNA的提取产物极易降解，给实验带来较大的困难。因此如何快速提取RNA并防止RNA的降解而使之储存较长的时间，一直是分子生物学研究人员要解决的一个难题。尽管RNA的提取已经成为很成熟的技术，但在实际研究中经常很难做到顺利获得质量好的RNA。这归咎于很多因素，如材料保存不合理、器皿不洁净、操作不严等，造成RNA的降解。

有关植物RNA的提取方法较多，现有的方法主要有异硫氰酸胍法、SDS/酚法、CTAB-LiCL法等，这些方法已经被广泛用于许多植物组织总RNA的提取，但有一些植物组织中内含物极为复杂，尤其是在富含多糖、多酚、单宁及一些尚未能确定的次生代谢物等情况下，不利于RNA的分离纯化。这些方法在应用时均存在一定的缺陷，如提取时间长，提取所需的条件苛刻，提取率低，提取的总RNA完整性较差等缺点。然而，RNA质量的好坏，决定着实验结果的可信度高低。因此获取一种简单、快速的植物组织总RNA提取方法具有重要意义。

柳枝稷（英文名Switchgrass，拉丁名Panicum virgatumlinn），又称“能源草”，因其栽培技术简单，适应性广，防风固沙能力强，耐贫瘠，生物学产量高，被国际上确定为生产染料乙醇的首选生物能源植物，并投入了大量的人力、物力进行研究开发。其中，采用基因工程技术增加生物学产量，降低木质素含量和提高乙醇产率等方面已成为目前的研究热点之一。而高质量高纯度RNA的提取是生物技术的主要组成部分之一，在遗传转化体系的建立中具有十分重要的意义。柳枝稷因含纤维素及其他杂质较多，使其在提取RNA初期的研磨过程中较难研磨彻底，且耗费时间过长，影响柳枝稷RNA提取效率。

本发明提出的一种简单、快速提取植物组织总RNA方法，是植物进行转基因技术的重要前提。本发明的目的是要提供一种能使提取植物总RNA的时间更短、操作简单、成本低廉、提取效率更高的总RNA提取方法，是由以下方式实现的。首先在研磨过程中加入碳化钨研磨珠，使得研磨时间缩短，且研磨效果更好。其次总RNA提取液含有RNA酶的高效抑制剂、去垢剂、pH调节剂。高效抑制剂有异硫氰酸胍、水饱和酚，去垢剂为十二烷基肌氨酸钠，pH调节剂为NaAc缓冲液。该RNA提取液成本较低，且简便易得。本发明的总RNA提取方法包括样品研磨、核酸释放、氯仿抽提、异丙醇沉淀、清洗风干五步，提取过程简单，操作时间短（30-40min），经济有效，提取率高，提取的总RNA完整性好，适用于植物分子生物学操作。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单、快速提取植物组织总RNA的方法，操作简单，提取时间短，重复性好，适用性强，能获得高质量、高浓度的RNA，为进一步分子生物学研究奠定了基础，结果准确有效。

本发明所提供的一种简单、快速提取柳枝稷组织总RNA的方法，按照下述步骤进行：

（1）样品研磨：取约0.5~1g新鲜的柳枝稷叶片或茎材料于研钵中，加入3mm碳化钨研磨珠3~5个，加入液氮后迅速研磨，重复数次直至磨成粉末，研磨时间控制在1min，将研磨后的粉末加入预冷的1.5mL EP管中；

（2）核酸释放：向步骤（1）中的离心管中加入1mL 配制好的RNA提取液，充分振荡，使其混合均匀，平行放置8-10min；

（3）氯仿抽提：12000~14000r/min离心5~8min，取上清液600~800微升转入新的1.5mL EP管中，加入预冷的250~300微升氯仿，在涡旋器上涡旋15s，使其充分混匀；

（4）异丙醇沉淀：12000~14000r/min离心8~10min，取上层水相200~300微升

转入新的1.5mL EP管中，加入200~300微升

异丙醇，上下颠倒数次；