[发明专利]RecA介导的特异性目的DNA片段捕获方法

说明书

技术领域

本发明属分子生物学-生物化学技术领域，涉及捕获样品中的同源目标DNA片段的方法，尤其涉及在RecA的介导下特异性捕获样品中的同源目标DNA片段的方法。该方法可用于外显子或其他目的片段的捕获测序，为肿瘤和其他疾病罕见的突变位点检测提供技术帮助。

背景技术

研究显示，外显子测序为疾病检测和机理研究提供了更为有效的技术手段，与传统的人类全基因组测序相比，外显子测序在检测新的致病基因，特别是罕见的基因变异，表现出很高的检测效率。据报道，通过外显子测序，能够辨别出一系列全基因组测序可能遗漏的少见的单核苷酸多态性变异(SNPs)，DNA错义突变以及基因序列的插入和缺失。但是外显子测序的高费用和高时耗依然是限制其大规模使用的重要因素，而且外显子测序时探针杂交易出现非特异性，探针设计时需考虑Tm值以使其具有均一的覆盖度，所需样品初始量相对较大，诸多因素严重限制了其在临床疾病研究中的大规模应用。

现有技术公开了如下信息：在生物的进化过程中，同源重组是遗传信息改变过程中的一个重要的发生事件。同源重组是指两条具有同源性的DNA，通过碱基配对，链断裂和再连接，从而引起DNA片段重新组合的过程。生物的各种代谢过程都是在酶和各种蛋白因子的帮助下高效特性的完成的。有研究显示，RecA蛋白是大肠杆菌中参与同源重组最重要的因子；在真核生物中，与RecA同源的Rad51基因以及一系列的相关基因，参与真核生物的同源重组过程；RecA蛋白在原核生物同源重组过程中，以首尾相连的方式覆盖在DNA单链上；每个RecA分子结合3个核苷酸，这种RecA单链复合物可以和双链DNA结合并扫描其同源序列；当发现同源序列后，双链DNA解螺旋，单链DNA在RecA带领下侵入解螺旋的双链DNA分子，入侵单链与双链DNA中的互补序列发生碱基配对，序列相同的DNA链被置换出来，链的置换效率和探针-目的DNA的同源长度以及目的DNA的三维构象有关系；置换方向沿着5’-3’的方向进行，其中探针3，端碱基必须严格配对；同源重组过程由RecA水解ATP提供能量，当用ATP-γ-S代替ATP时，则无法水解，反应阻抑在三链复合体的过渡态。

发明内容

本发明的目的是提供一种RecA介导的特异性目的DNA片段捕获方法。本发明利用所述的稳定的三链复合体，设计同源探针以捕获目的DNA片段，进而分离和纯化与目的DNA片段上结合的蛋白调控因子和具有调控作用的RNA分子，通过捕获靶基因片段进行高通量基因测序进行样本制备。

本发明中，根据RecA在体内同源重组中的作用模式，尤其是在原核生物大肠杆菌中介导同源重组的作用模式，在体外模拟其过程，设计针对目的DNA片段中58bp长度的同源DNA序列为探针，在含有RecA和ATP-γ-S的反应体系中特异性的捕获样品中的同源目标DNA片段。

本发明中，采用ATP和H₂O解除RecA介导的稳定的三链复合体而作为高效的洗脱试剂，其中Mg²⁺和Ca²⁺为稳定形成三链复合体所必须，而ATP对三链复合体的形成具有显著的抑制作用，室温下用H₂O可以特异性的洗脱目标DNA片段，本发明方法可提高洗脱效率，减少高温变性等较强烈洗脱条件下的非特异性问题。

更具体的，本发明的RecA介导的特异性目的DNA片段捕获方法，其包括步骤：设计探针预先与RecA在37℃孵育，然后加入含有目标样品的DNA继续孵育，加入含有0.2％的NP40的1×RecA缓冲液洗涤非特异性DNA，最后通过洗脱试剂特异性地洗脱目的DNA片段。

本发明中，所述的样品是指经过酶切或超声将基因组断裂成500-1000bp的DNA片段。

本发明中，洗脱试剂选自ATP或H₂O，所述的ATP和H₂O分别对RecA介导形成的三链复合体具有解除稳定的作用，通过ATP或H₂O进行洗脱探针捕获目的DNA片段。

本发明中，洗涤非特异性的缓冲液中，含有Ca²⁺或Mg²⁺等二价阳离子，所述的二价阳离子是维持稳定的目的片段参与形成的三链复合体所必须的。

本方法可用于外显子或其他目的片段的捕获测序，为肿瘤和其他疾病罕见的突变位点检测提供技术改进，能避免目前外显子或其他目的片段捕获过程中探针设计需要Tm值均一性，探针杂交具有非特异性，所需样品初始量相对较大等问题。