[发明专利]一种在酵母中制备重组胱抑素C的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因重组胱抑素C的制备方法，具体地说，涉及一种在酵母中制备重组胱抑素C的方法。

背景技术

胱抑素C(Cystatin C或简称Cys C)是半肤氨酸蛋白酶抑制剂超家族2中的成员之一。它的分子量为13kD，是由122个氨基酸组成的低分子量非糖基化蛋白质，且能在所有有核细胞中恒定、持续地转录及表达，可被看做House keeping基因。胱抑素C是一种小分子血浆蛋白质，为半胱氨酸蛋白酶抑制剂，人体的有核细胞都能稳定地产生。胱抑素C可被肾小球自由滤过，其浓度与肾小球滤过率呈负相关，不受性别、年龄、饮食、炎症、血脂、肝脏疾病等因素的干扰，可以较准确的反映肾功能损伤。因此胱抑素C是一种理想的反映肾小球滤过率(GFR)变化的内源性标志物。目前国内外都把胱抑素C作为公认的肾功能检测指标。鉴于当前全球慢性肾脏病发病率不断上升，胱抑素C作为临床检查的诊断价值日益引起人们的重视。

血浆胱抑素C浓度的测定具有重要的诊断意义。但目前我国基本上还没有自主研发的胱抑素C诊断试剂，原因就在于制备胱抑素C诊断试剂盒需要特异性强和灵敏性高的抗胱抑素C单克隆抗体，而要得到该单克隆抗体就必须得到高纯度的胱抑素C蛋白。以前主要是从患者尿液中提取胱抑素C，不仅来源受限制，而且成本高，产量也极低。用基因重组方法生产胱抑素C，可以解决这一系列问题。

传统方法从病人尿液中提取胱抑素C具有难以克服的缺点，例如：得率很低；批间差很大；存在生物安全隐患，难于工业化生产等。而基因工程方法来表达，生产重组蛋白质不会存在这些问题。最常用的基因工程蛋白表达系统包括大肠杆菌和酵母系统。

在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是大肠杆菌表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统。其主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)等诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。

对于表达不同的蛋白，需要采用不同的载体。目前已知的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融合型表达载体两种。非融合表达是将外源基因插到表达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游，以外源基因mRNA的AUG为起始翻译，表达产物在序列上与天然的目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或多肤与另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合并在菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体。

作为发展最早、目前应用最广泛的经典表达系统，大肠杆菌表达系统优点在于遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。

酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用。最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母。但与新型酵母体系相比，酿酒酵母表达系统存在不适合高密度培养、缺乏强有力的严格调控的启动子，而且分泌效率较低，尤其是许多分子量大于30kD的外源蛋白几乎不分泌等缺点，通常不被看作是重组蛋白的理想宿主。后来人们又相继开发了裂殖酵母、甲醇酵母等。

甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有HPolymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris 3种，并以Pichia Pastoris应用最多。甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因(AOX1)，在该基因的启动子(PAOX1)作用下，外源基因得以表达。PAOX1是一个强启动子，在以葡萄糖或甘油为碳源时。甲醇酵母中AOX1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时PAOX1可被诱导激活，因而外源基因可在其控制下表达，将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。

大肠杆菌系统表达重组蛋白的操作步骤包括：

(1)目的基因的取得：目的基因可以从适当的供体生物包括微生物、动物或植物中提取，也可以由化学合成法合成有特定功能的目的基因；