[发明专利]紫贻贝C型溶菌酶及其制备方法

权利要求书

1.紫贻贝C型溶菌酶，其特征在于该紫贻贝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的紫贻贝C型溶菌酶，其特征在于表达所述的紫贻贝C型溶菌酶的C型溶菌酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的紫贻贝C型溶菌酶的制备方法，其特征在于其步骤如下：

1）紫贻贝总RNA的提取：用Trizol试剂从鳗弧菌感染的紫贻贝血淋巴中提取总RNA，存于-80 ℃备用； 

2）紫贻贝mRNA纯化：用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA；

3）紫贻贝cDNA模板制备：用cDNA Synthesis Kit试剂盒将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit纯化试剂盒对大于100 bp的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与Uni-ZAP XR vector载体连接，得到cDNA质粒，用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit试剂盒对cDNA质粒进行噬菌体包装、滴度测定、噬菌体文库扩增，扩增后的噬菌体文库加入体积百分终浓度为7% 的二甲基亚砜，得到含核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示的C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液，存于-80℃；

4）基因克隆：对上述含C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液进行PCR扩增，PCR扩增的引物如下：正向引物序列TTACTTGTCT TGGTACTTGT G，反向引物序列TTTGTATGCT ATTTTATTTT G，3’端PCR扩增的反应体系和反应条件为：10 × PCR buffer 2.5 μl、25 mM的MgCl₂ 溶液1.0 μl、2.5 mM的dNTP溶液 2.0 μl、10 μM 的上述正向引物溶液1 μl、10 μM 的通用引物T7溶液1 μl、浓度为5 U/μl的Taq DNA聚合酶0.2 μl，所述cDNA 模板溶液1 μl，用PCR 水定容到25 μl，反应条件为94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性45秒，60 ℃退火30秒，72℃延伸60秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟；5’端PCR扩增反应体系和反应条件为：10 × PCR反应缓冲液2.5 μl、25 mM的MgCl₂ 溶液1.0 μl、2.5 mM的dNTP溶液2.0 μl、10μM 的上述反向引物溶液1 μl、10μM的通用引物T3溶液1 μl、浓度为5 U/μl的Taq DNA 聚合酶0.2 μl，所述cDNA 模板溶液1 μl，用PCR 水定容到25 μl，反应条件为94℃ 预变性5 分钟，然后进入下列循环：94℃变性 45 秒，60 ℃ 退火30 秒，72℃延伸60秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物经胶回收试剂盒纯化，与pMD18-T载体连接得到克隆质粒，转入大肠杆菌TOP10F感受态细胞中，挑选阳性克隆提取质粒，得到C型溶菌酶基因的克隆质粒； 

5）表达质粒构建：以上述C型溶菌酶基因的克隆质粒为模板进行PCR扩增反应，扩增反应的正向引物为含有Nco I酶切位点的核苷酸序列： CCATGGCTAC AAAAACGAAG TGCCA，反向引物为含Xho I酶切位点和6个His纯化标签的核苷酸序列：CTCGAGTTAG TGGTGGTGGT GGTGGTGACA TGTGCTGTAA TCGT；将扩增片段纯化回收，导入pMD18-T载体，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌TOP10F感受态细胞中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Nco I和Xho I双酶切亚克隆质粒；用胶回收纯化试剂盒对酶切产生的目的片段纯化回收，并将该片段导入经同样双酶切的表达载体pET-21a (+)中，构建得到C型溶菌酶的表达质粒；

6）表达质粒表达：将上述表达质粒转入表达宿主菌BL21 (DE3) plysS，筛选阳性克隆并经测序确认，将阳性克隆接种于LB培养基中，220rpm，37℃培养至OD₆₀₀=0.5-0.7，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，使其终浓度达到0.6 mM，继续培养5 h，然后8000rpm离心10分钟收集菌体；

7）蛋白纯化：对上述菌液超声破碎、离心获得包涵体，并对包涵体进行洗涤和溶解，然后采用镍柱亲和层析纯化，最后对纯化产物进行透析、复性得到氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示的紫贻贝C型溶菌酶。