[发明专利]苹果种质资源改良TP-M13-SSR分子标记方法

说明书

技术领域

本发明涉及果树分子生物学技术，具体地说是苹果种质资源改良TP-M13-SSR分子标记方法。

背景技术

苹果属(Malus Mill.)种质资源丰富，品种类型多样，包括大量的野生种、半野生种及栽培品种。苹果种质资源的准确鉴定是种质资源保存和利用的前提，以往主要利用形态学观察、同工酶等方法进行鉴定。随着分子生物学技术的发展，其在苹果种质资源的研究中也得到了越来越广泛的应用。

自Litt和Luty首次将SSR技术(simple sequence repeat，即简单序列重复又称微卫星)用于进行人类遗传学研究以来，SSR技术因多态性高、分布广、重复性好、共显性以及成本较低等优点而被广泛应用，也因此而被应用到苹果种质资源的鉴定中。传统的SSR分子标记PCR产物检测采用的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，分析通量较低、扩增产物检测流程繁琐、数据记录的工作量过大。而荧光测序技术即毛细管电泳技术在SSR-PCR扩增产物检测上的应用，实现了数据收集和处理的自动化，克服了银染法的不足。但其一个重要限制因素即是其成本过高，一旦实验需要增加另外的SSR位点时，又必须得重新合成新增位点的荧光引物，该技术也仅仅在少量材料和较少位点的研究中应用较多。

TP-M13-SSR分子标记技术是将SSR分子标记技术、荧光测序技术相结合的高通量、低成本的高效、快速、准确的检测方法，如何能将两次PCR程序合并为一次，不同SSR分子标记引物合并到同一体系中，则可减少操作步骤，最大限度的减少人为实验误差，并且可以进一步的提高实验效率。

发明内容

为了能够将TP-M13-SSR分子标记技术中不同SSR分子标记引物合并到同一体系中，并能将两次PCR程序合并为一次，尽可能地减少操作步骤，最大限度的减少人为实验误差，进一步的提高实验效率。本发明提出了苹果种质资源改良的TP-M13-SSR分子标记技术。

本发明解决技术问题所采用的方案是：

1、提取苹果基因组DNA，并稀释到20 ng/μL。

2、SSR荧光标记反应：

（1）TP-M13-SSR反应体系： 

模板DNA：2.0ul；

Mg²⁺（25mM）：1.62ul；

TP-M13-SSR引物1：P-Primer（2uM）：1.2 ul；F-Primer（2uM）：0.12 ul； 

TP-M13-SSR引物2：P-Primer（2uM）：1.2 ul；F-Primer（2uM）：0.12 ul；

TP-M13-SSR引物3：P-Primer（2uM）：1.2 ul；F-Primer（2uM）：0.12 ul； 

同一荧光标记的M13接头：1.8 ul；

Buffer(10×)：2.25ul；

dNTP(25 mM)：0.18 ul；

Taq(5u/ul)：0.24 ul；

ddH₂O：2.95 ul；

Total：15 ul。

（2）PCR程序：

94℃预变性5min；94℃变性30s，An.T退火30s，72℃延伸45s，30个循环；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，16个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。不同引物扩增所需要的An.T即退火温度不同，因此需要经过实验确定在同一体系中的三对引物具有相同的退火温度。

三对具有相同退火温度的TP-M13-SSR引物与同一荧光颜色的M13接头在15 ul的反应体系中，采用两套循环的一次PCR反应，在PCR仪上进行扩增，从而实现一次PCR反应三对TP-M13-SSR引物的PCR扩增及同一颜色的荧光标记。

3、TP-M13-SSR标记的荧光检测

TP-M13-SSR扩增产物经过纯化，不同荧光颜色标记的PCR扩增产物（最多四色）在毛细管电泳仪（如ABI3730）上进行毛细管电泳检测。

4、数据分析：

电泳结束后，得到数据利用Genescan和Genotyper两套软件进行分析，自动获取所有数据，最后得到所有样品的毛细管电泳图谱，即SSR指纹图谱，从而完成TP-M13-SSR荧光标记。