[发明专利]一种Taq DNA聚合酶冷启动活性检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶活性的检测方法，具体说是一种Taq DNA聚合酶冷启动活性检测方法。

背景技术

1985年，美国Cetus公司的Kary.B.Mullis发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR），实现了人们在体外无限扩增DNA片段的梦想。而Saiki首次应用PCR法成功的扩增了人β-珠蛋白DNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。

Mullis在建立PCR发明的初期，采用非常简单的三种温度水浴进行实验，应用的是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段来催化复性引物的延伸效应。其缺点是：①Klenow片段不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都要重新补加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow片段催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow片段不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶失活，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。

1988年，Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA聚合酶。此酶的发现使PCR技术进入了实用阶段，随后PE-Cetus公司推出了第一台自动化PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。PCR技术在微生物学，遗传病学，肿瘤学和法医学领域中的应用越来越广。 

随着PCR技术的应用，发现PCR产物中经常会出现非特异性扩增片段和引物二聚体，影响PCR的扩增效率和目的DNA片段的产量。经过研究发现，Taq DNA聚合酶的最适反应温度虽然在72℃，但是在室温及其以下温度，Taq DNA聚合酶仍然具有聚合酶活性，可以延伸错配的引物，如引物自身，引物之间，引物和模板等非特异性产物，一旦形成，就会被有效扩增，从而产生大量非特异性扩增和引物二聚体。为了与耐热DNA聚合酶的热启动活性相区别，我们将耐热DNA 聚合酶这种在室温及其以下温度所具有的活性定义为DNA 聚合酶冷启动活性 。

常用的限制DNA 聚合酶冷启动活性的方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪，这种方法并不能完全抑制DNA 聚合酶冷启动活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。为了限制Taq DNA聚合酶冷启动活性，降低非特异性扩增和引物二聚体的产生，提高目的片段的产量，人们想出了各种各样的办法，如成分隔离，化学修饰，抗体，突变等，并在实际实验中取得了良好的效果。但是，虽然大多厂商宣称其产品具有热启动活性，其实并没有客观有效的手段来证明其没有冷启动活性，多是提供一张PCR扩增产物的电泳图，显示热启动DNA聚合酶扩增条带清晰，没有非特异性扩增和引物二聚体。因为一般的Taq DNA聚合酶也可以扩增出没有非特异性扩增和引物二聚体的清晰的目的条带。我们检索文献发现目前尚缺乏客观有效的技术手段来检测Taq DNA聚合酶冷启动活性。

发明内容

本发明针对上述问题的不足之处，提供一种Taq DNA 聚合酶冷启动活性检测方法，该方法操作简便，灵敏度高，微弱的冷启动活性也可以被有效检测。

一种Taq DNA 聚合酶冷启动活性检测方法，其具体操作步骤为：

（1）引物和假模板的设计及合成

选择任意一段已知序列的DNA作为模板，根据模板DNA序列，利用引物设计软件设计一对PCR引物，并进行人工合成，其包括正义引物和反义引物；人工合成一DNA片段，使其5‘端部分与上述PCR引物的正义引物或反义引物互补，3‘端部分与模板DNA的序列完全不同，将这段DNA命名为假模板；假模板3‘端部分与模板DNA的序列完全不同的部分，其长度为3～30个碱基，优选为8～18个碱基。

（2）PCR反应前假模板与引物的处理