[发明专利]特异性检测禾本科植物上大孢指疫霉菌的PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种大孢指疫霉菌(Sclerophthora macrospora)的检测方法，具体涉及一种特异性检测禾本科植物上大孢指疫霉菌的PCR(聚合酶链式反应)技术。

背景技术

大孢指疫霉菌是指疫霉属的一种真核菌，属于卵菌纲，此纲的成员的有性阶段产生卵孢子。此菌寄生于多种禾本科植物，易引起霜霉病。水稻受霜霉病危害之后心叶淡黄、卷曲、不易抽出，下部老叶逐渐枯死，植株矮缩，不能抽穗或花器畸形，在局部地区造成严重损失。

水稻霜霉病的诊断一般首先从症状上初步判断，再用显微镜检查病组织，如果检查到病菌卵孢子即确定为阳性。但检查到卵孢子时用药防治为时已晚，即便植株可以抽穗，也不能正常结实。而早期的症状不易与除草剂药害和病毒病相区分。因此有必要建立一种早期检测技术，对未镜检到卵孢子的疑似病株进行诊断。

在植物病原物的检测上，PCR是一种准确、高效、应用最广的技术，但应用于大孢指疫霉菌的检测方面，尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种特异性检测禾本科植物上大孢指疫霉菌的PCR方法，其依据大孢指疫霉菌已经报告的核糖体大亚基RNA基因序列来设计特异性PCR引物，建立起PCR诊断技术体系，可检测到多种禾本科植物如水稻、玉米等上的大孢指疫霉菌，解决水稻霜霉病早期检测难的问题。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种特异性检测禾本科植物上大孢指疫霉菌的PCR方法，该方法是以大孢指疫霉菌特异性引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定，该特异性引物为：

正向引物：5’-AGAATGCAGCGCTAAGC-3’(如SEQ ID No：1所示)

(对应于EU826119.1的第207-223个碱基)，

反向引物：5’-ATGCGCATCCACTCAGC-3’(如SEQ ID No：2所示)

(对应于EU826119.1的第629-613个碱基)。

详述如下：

一、引物的设计：

发明人根据真核生物核糖体RNA基因碱基序列的特异性，从NCBI/GenBank搜索并下载大孢指疫霉菌HUH 892菌系核糖体大亚基RNA基因碱基序列(GenBank：EU826119.1共846个碱基)，只得到一条序列。

依据此序列用primerBLAST工具设计特异性PCR引物序列如下：

正向引物：5’-AGAATGCAGCGCTAAGC-3’

(对应于EU826119.1的第207-223个碱基)

反向引物：5’-ATGCGCATCCACTCAGC-3’

(对应于EU826119.1的第629-613个碱基)；

上述引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。PCR产物预期大小为423个碱基。

将正向引物和反向引物分别经BLAST检索，见图1和图2。结果表明：与正向引物序列和反向引物序列均100％覆盖且碱基100％相同的只有EU826119.1。

二、病菌的PCR过程(以水稻来进行说明)：

DNA的提取：按常规方法对疑似感染大孢指疫霉菌的水稻植株提取基因组DNA。

用上述设计的引物对对提取的疑似感染大孢指疫霉菌的水稻植株总DNA进行扩增，预计扩增片段约为423bp。

PCR扩增体系(25μl)：DNA扩增模板1μl、10×PCR Buffer 2.5μl、dNTPs(10mm)0.5μl、Taq酶(2.5μ/μl)0.5μl、Forward Primer(10mm)1μl、Reverse Primer(10mm)1μl、及dd H₂O 18.5μl。

扩增条件：预变性94℃5min；循环参数：94℃30sec；56℃40sec；72℃40sec；共30个循环；72℃10min延伸。

三、PCR扩增产物的鉴定：

扩增产物经常规电泳并用凝胶成像系统检查，结果出现的条带与预期的大小相符，见图3。

PCR产物送由宝生物工程(大连)有限公司测序，测序结果经BLAST，只找到作为引物设计基础的EU826119.1，见图4。

本文中提及的PCR技术包含从PCR衍生的所有技术，如实时荧光PCR。