[发明专利]利用毕赤酵母表达系统生产猪圆环病毒2型衣壳蛋白颗粒样疫苗的方法

权利要求书

1.猪圆环病毒2型衣壳蛋白CAP颗粒样疫苗是通过以下方法制得的：

(1)Cap蛋白基因的扩增

以GenBank中PCV2-TJ(序号AY181946)毒株基因序列为模板，用软件Primer5.0设计一对引物，在两条引物的5端分别加入FokI和SalI酶切位点：

P1：5’CGTGGTCTCCAGGTATGACGTATCCAAGGAGGCGT3’

P2：5’GGTCTCAGATCTTCAAGGGTTAAGTGGGGGGT3’

以PCV-2感染的PK15细胞培养物中提取的DNA产物为模板，应用PCR技术扩增出了实验室分离毒株PCV-2的Cap蛋白全基因。该基因片段大小为722bp；

(2)分泌型表达载体的构建、筛选、鉴定：

通过设计的FokI/SalI双酶切位点，将目的基因Cap克隆入赤酵母分泌型表达载体pP-secSUMO3中，转入大肠杆菌JM109，用PCR和双酶切方法鉴定得到重组菌株pP-secSUMO3-Cap。

(3)Cap蛋白的表达：

阳性重组质粒经纯化、线性化处理后用BioRad公司电转仪电转化毕赤酵母菌株GS115，Zeocin Tm浓度梯度筛选高拷贝菌株，挑取单克隆菌培养，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选阳性表达菌。将重组阳性表达酵母菌上清经镍柱纯化分离后，加入SUMO蛋白酶2同步进行透析和标签切除，再次过镍柱纯化后，制得猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap。

(4)利用纯化的猪圆环病毒2型衣壳蛋白，辅以佐剂，制备猪圆环病毒2型颗粒样疫苗。

2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型衣壳蛋白，其特征在于，所述引物P1、P2为：

P1：5’CGTGGTCTCCAGGTATGACGTATCCAAGGAGGCGT3’

P2：5’GGTCTCAGATCTTCAAGGGTTAAGTGGGGGGT3’。

3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型衣壳蛋白，其特征在于，所述的聚合酶链式反应(PCR)的条件为：

50μl的PCR体系如下：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺Plus)10μl，2.5mmol/LdNTPs4μl，20mmol/L引物各1μl，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl，灭菌三蒸水33μl，DNA模板1μl；PCR的反应程序为：98℃10s，55℃5s，72℃40s，35个循环，72℃延伸7min，4℃保存。

4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型衣壳蛋白，其特征在于，所述酵母表达载体是pP-secSUMO3。

5.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型衣壳蛋白，其特征在于，毕赤酵母菌株GS115。

6.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型衣壳蛋白，其特征在于，所述步骤(4)中所述佐 剂为水性佐剂或油性佐剂。

7.根据权利要求1～5任意一项方法生产的重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白。

8.根据权利要求1～6任意一项方法生产的重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白颗粒样疫苗。