[发明专利]显微镜成像的校准靶

说明书

相关申请的交叉引用

该申请要求2010年9月29日提交的美国临时专利申请号61/246,644的优先权；其的公开通过引用全文结合于此。

技术领域

本公开涉及显微镜成像技术，并且具体地涉及用于提高显微镜放大倍率的系统和方法。

背景技术

在现代科学研究中采用许多不同类型的成像系统来采集小或远的物体的图像，包括极高分辨率电子显微镜、极高分辨率扫描隧道（“STM”）与原子力（“AFM”）成像仪器和许多不同类型的光学显微镜、望远镜与图像生成传感器。如同大多数类型的成像装置、仪器和技术，存在与不同类型的显微镜方法关联的许多不同的折衷和平衡。例如，透射电子显微镜方法对固定和薄切片样品进行，并且因此约束于对基本上二维、无生命样品使用。扫描隧道和原子力显微镜方法是用于获得材料表面的高分辨率图像的非光学技术，但不可以用于获得关于表面下方样品的体积的纳米尺度或微米尺度内含物的信息。所有类型的显微镜方法无论如何受分辨率限制约束，而光学显微镜方法与称为“衍射极限”的可能最有名的分辨率限制关联，其将传统可见光光学显微镜方法限制于大约200nm的分辨率极限。

在过去的20年期间，开发了各种超分辨率技术来允许荧光团-标记样品（最经常是生物样品）由光学荧光-显微镜方法仪器以显著低于传统光学显微镜方法的衍射-限制分辨率的分辨率的成像。这些技术基于收集从荧光团-标记样品随时间发射的荧光。假如发射荧光团按大于大约200nm的距离彼此分开，或换句话说，假如荧光团在样品中的位置将可由传统光学显微镜方法分辨，可以确定荧光团在样品中的位置，在某些情况下达到10nm以下的分辨率。然而，因为仅当发射荧光团在样品内稀疏布置时可以解释荧光-发射信号，一般需要从不同组的稀疏布置的荧光团产生大量的中间图像，以便构建荧光团-标记物体的超分辨率最终图像。从而超分辨率图像以积累相对弱的信号来产生更大量的中间图像需要的时间为代价而获得。超分辨率成像需要的时间不利于活细胞的成像，其趋于在收集相对弱的信号（从其构建超分辨率图像）需要的时间段期间移动和改变形状。收集相对弱的信号需要的长时间段还可导致活细胞暴露于有害或致命水平的电磁辐射，其包括紫外光。采集用于超分辨率成像的足够数据需要的时间还可代表显著的实验约束，而不管成像的样品的类型。由于所有这些原因，设计和开发、制造光学显微镜的那些人继续寻找系统和方法来捕捉衍射极限以下的图像。

发明内容

该公开针对光学显微镜校准装置，其可以与光学显微镜一起使用来调节显微镜成像参数使得样品的图像可以在衍射极限以下获得。这些显微镜校准装置包括至少一个校准靶。每个校准靶包括具有显微镜物镜的衍射极限以下的尺寸的多个特征。对特定放大倍率获得校准靶中的一个的单独颜色分量衍射限制的图像。图像处理可以用于组合这些颜色分量图像，并且获得校准靶的聚焦并且无畸变的图像。用于获得校准靶的该聚焦并且无畸变的图像的参数可以用于用相同的参数获得对相同放大倍率的样品的聚焦并且无畸变的图像。

附图说明

图1A-1C示出光学显微镜校准装置的不同视图。

图2示出接收从物面中的点源输出的光并且分散开来在对应像面中产生斑点的光学系统。

图3A-3B示出理论点扩散函数的示例表示。

图4示出与光学系统关联的衍射极限。

图5示出固定到显微镜载玻片的表面的校准装置。

图6示出附连到载玻片的表面的校准装置的横截面视图。

图7示出具有附连的校准装置的载玻片的横截面视图。

图8A示出显微镜内的光学路径，该显微镜具有发射在可见光谱中波长的宽范围上的光的光源。

图8B示出从校准靶的子区中的孔输出的光束的一示例。

图8C示出与从校准靶的子区中的孔输出的光关联的三个单独颜色分量图像的一示例。

图8D示出具有各自发射在可见光谱的不同波长范围中的光的单独光源的显微镜的一示例。

图9A-9B示出与校准靶的子区关联的一系列原像的示例表示。

图10示出用于校正物镜的色差和衍射极限的图像校准的一假设示例。

图11A-11D示出当校准原像来产生校准图像时要确定的校准参数的图形表示。

图12示出在与校准靶的子区关联的三维图像空间中的区的假设透视图。

图13示出具有六个单独校准靶的光学显微镜校准装置。