[发明专利]无网格BAC文库的建立方法及该无网格BAC文库阳性克隆的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种简便基因文库的建立与筛选。

背景技术

BAC(细菌人造染色体)克隆对于整个分子生物学的发展，特别是现代基因组学的发展作出了巨大的贡献。虽然，现在高通量测序技术降低了BAC文库的利用率，但是BAC克隆对于基因克隆及基因资源的保存有着重要的作用。制取BAC克隆，一般放入96孔板或384孔聚乙烯样品板中，但是所要的超低温(-80℃)储藏空间巨大；而且，利用BAC克隆筛选还要制作有关的三维筛选体系或转移至纤维素或尼龙杂交膜中，需一系列的筛选过程来获得阳性克隆。无网格(混合克隆品)基因文库已经展现出所需劳动力少，贮存所需的空间小，但从阳性克隆混合体中获取其所需个体较为复杂。

虽然已有人进行过BAC文库的筛选，但是程序复杂，且操作规程不明确。目前的常规方法是将混合样品涂布平板后，待菌落生长后，转移到纤维素膜上，进行有关杂交，来鉴定相应的阳性克隆。由于DNA杂交技术程序复杂，花费时长，还存在假阳性等问题，特别是难以获得单个阳性克隆。

发明内容

本发明的是为了解决现有无网格BAC文库阳性克隆技术中DNA杂交技术程序复杂，花费时长，存在假阳性，而且难以获得单个阳性克隆的问题，而提供的一种无网格BAC文库的建立方法及该无网格BAC文库阳性克隆的筛选方法。

本发明无网格BAC文库按以下步骤建立：

一、BAC克隆载体的制备；

二、大片段DNA的制备；

三、连接及转化，然后选择含BAC克隆1000～3000个的培养皿，用LB液体培养基或SOB液体培养基进行洗脱，均制成BAC克隆的悬浮液，混合均匀后都等分为2管，一组管为DNA提取筛选管，另一组管为无网格BAC文库管，即实现无网格BAC文库的建立。

按以下步骤筛选上述无网格BAC文库以获取阳性克隆：

一、用待筛选序列的特异性引物对BAC文库中的DNA提取筛选管进行PCR，取阳性pool所对应的无网格BAC文库管，并吸取200μL菌液，进行梯度稀释；

二、将步骤一制备的梯度稀释液振荡培养；

三、将步骤二振荡培养的菌液取出一部分进行离心，弃去上清液后用沉淀的菌体离心进行PCR，选取滴度最大的菌液进行涂板，然后，一次用牙签钝端挑取8～15个克隆放入96孔板或384孔板中振荡培养，取少量振荡培养物再次进行PCR反应，将阳性克隆pool进行再次涂板，选取单个克隆进行验证，即可获得单个阳性克隆。

本发明无网格BAC文库的建立方法简单易行，具有用时短，所需超低温储藏空间小的优点。

本发明无网格BAC文库阳性克隆的筛选方法巧妙地利用PCR体系，快速简易地获得阳性克隆，并且有效的排除了假阳性克隆的干扰。

附图说明

图1是具体实施方式六步骤四中PCR的部分凝胶电泳图，其中第1泳道和第18泳道标样为DNA对照样品，其余泳道标样为DNA提取筛选管样品。

图2是具体实施方式六步骤六中单个阳性克隆验证结果图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式无网格BAC文库按以下步骤建立：

一、BAC克隆载体的制备；

二、大片段DNA的制备；

三、连接及转化，然后选择含BAC克隆1000～3000个的培养皿，用LB液体培养基或SOB液体培养基进行洗脱，均制成BAC克隆的悬浮液，混合均匀后都等分为2管，一组管为DNA提取筛选管，另一组管为无网格BAC文库管，即实现无网格BAC文库的建立。

本实施方式BAC克隆的悬浮液中的LB液体培养基或SOB液体培养基(含10％的甘油)可作为冷冻用媒介，将BAC克隆的悬浮液置于-80℃环境中储藏。

BAC克隆载体的制备及大片段DNA的制备采用现有常规方法。

本实施方式含有阳性克隆1000～3000个的培养皿数量为50～100皿。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中大片段DNA片段的平均长度≥70Kb。其它步骤及参数与实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式按以下步骤筛选无网格BAC文库以获取阳性克隆：

一、用待筛选序列的特异性引物对BAC文库中的DNA提取筛选管进行PCR，取阳性pool所对应的无网格BAC文库管，并吸取200μL菌液，进行梯度稀释；