[发明专利]脱氧次黄嘌呤在脱氧寡核苷酸链连接反应中的应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种脱氧次黄嘌呤在脱氧寡核苷酸链连接反应中的应用。

(二)背景技术

由任意序列寡脱氧核苷酸组成的寡脱氧核苷酸文库(oligonucleotide libraries)已被广泛地应用于测序、突变体诊断、基因表达和微生物鉴定。但是，寡脱氧核苷酸文库的应用中有一个明显的不足之处，就是随着寡脱氧核苷酸链上碱基数的增加，文库按4倍比率(4^N，N为寡脱氧核苷酸链上碱基数)迅速变大，如8个碱基长的寡脱氧核苷酸全文库就包含65536(4⁸)种寡脱氧核苷酸链，从而导致：①难合成，尤其是长链寡脱氧核苷酸文库；②成本很高。为此，研究人员通过缩短寡脱氧核苷酸链长度来减小文库。但是，人们发现这样做有一些缺点，如杂交稳定性差、难区分末端错配等。有研究发现，既能减小文库又能克服以上这些缺点的一种比较有效的方法是在寡核苷酸链上加入通用碱基(universal base)，因通用碱基均能同4种常见碱基(鸟嘌呤即G、腺嘌呤即A、尿嘧啶即U和胞嘧啶即C)进行碱基配对，所以可以在不缩短寡脱氧核苷酸链的前提下，减小寡脱氧核苷酸文库。

除鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)和胞嘧啶(C)4种自然碱基外，次黄嘌呤(I)被发现存在于一些tRNAs的反义密码子(anticode)的第三位碱基的摆动性位置(wobble position)上，能够与mRNAs密码子上的腺嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶进行碱基互补配对。脱氧次黄嘌呤已作为通用碱基被成功加入到引物中用于PCR反应的DNA扩增及测序。还有报道说在PCR扩增反应时，当三种三磷酸脱氧核糖核苷酸浓度正常而第四种三磷酸脱氧核糖核苷酸浓度比较低时，三磷酸脱氧次黄嘌呤核苷酸能够被聚合酶所识别而纳入到PCR产物中去。但是，到目前为止，通用碱基加入到寡脱氧核苷酸链而进行连接反应的相关研究工作还很少。已有研究发现当其他通用碱基3-硝基吡咯和5-硝基吡咯处在寡脱氧核苷酸链的5’-末端或3’-末端时，它们不能被T4DNA连接酶所识别。Luo等研究发现，当通用碱基3-硝基吡咯处于3’-末端附近时(仍然处于连接酶的活性位置)，它能够被Tth DNA连接酶所识别，并能提高连接反应的保真度。除了硝基吡咯，还没有对通用碱基脱氧次黄嘌呤在连接反应中的应用进行过研究和报道。而且，有别于硝基吡咯的很难被掺入到寡脱氧核苷酸链中，通用碱基脱氧次黄嘌呤很容易被掺入合成到寡脱氧核苷酸链中，现已有国内外多家公司能提供这方面的服务和技术支持，如美国的Integrated DNA Technologies(IDT)、国内的生工生物工程(上海)有限公司等，这为将脱氧次黄嘌呤作为通用碱基应用到连接反应提供了极大的可能性。本发明提供了一种对寡核苷酸链上不同碱基位置用脱氧次黄嘌呤进行单替代或多替代，并应用于连接反应的方法。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种在寡脱氧核苷酸链上不同的碱基位置用通用碱基脱氧次黄嘌呤进行单位点或多位点替换，并将之应用于寡脱氧核苷酸链连接反应。

本发明采用的技术方案是：

脱氧次黄嘌呤在脱氧寡核苷酸链连接反应中的应用，所述的应用为：脱氧次黄嘌呤I作为通用碱基对脱氧寡核苷酸单链中的碱基进行单位点替代或多位点替代，并与被替代脱氧寡核苷酸单链的互补链进行碱基配对，形成脱氧寡核苷酸双链。

所述单位点替代为下列之一：(1)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点处的第3个碱基位点及第3个碱基位点以上的位点替代腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G或胞嘧啶C；(2)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点处的第2个碱基位替代鸟嘌呤G或胞嘧啶C；(3)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点处的第1个碱基位替代鸟嘌呤G。

所述多位点替代为双位点替代，所述双位点替代为下列之一：1)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点处的第3和第4个碱基位替代胸腺嘧啶T；2)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第3和第5个碱基位替代胸腺嘧啶T；3)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第4和第5个碱基位替代胸腺嘧啶T、腺嘌呤A或胞嘧啶C中的一种。

所述多位点替代为三位点替代，所述三位点替代为脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第3、第4和第5个碱基位替代鸟嘌呤G。