[发明专利]血清miRNA-483-5p的定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种血清的检测方法，尤其是涉及一种血清miRNA-483-5p的定量检测方法。

背景技术

中国专利CN101793882A公开一种人血清中肿瘤标记物Bicr6蛋白的质谱筛选方法，其具体步骤为：取人血清，用磁珠吸附后洗脱得到磁珠富集液；将磁珠富集液加入基质溶液，按以下条件进行基质辅助激光解离电离飞行时间质谱检测：第一离子源电压：20kV；第二离子源电压：18.6kV；晶体电压：7.6kV；脉冲离子时间：320ns；极性：正；矩阵抑制模式：门控；门控强度：最大；抑制高限：600Da；检测器：1.4～1.5kV；样本率：1.00Gs/s；电子获取：增强，100mV；实时流畅：高；激光频率：20Hz；激光衰减：关73％，范围20％；质荷比为4964±1处的峰为Bicr6蛋白。该发明具有时间短、灵敏度高等特点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种血清miRNA-483-5p的定量检测方法。

本发明包括以下步骤：

1)取待检测血清与裂解液混合，裂解后用酚氯法析出RNA并回收小片段RNA；

2)取纯化miRNA在MMLV酶催化下应用特定引物将miRNA变为cDNA，然后将cDNA在EXtaq酶催化下应用miRNA-483-5p的PCR引物和探针进行定量PCR检测，条件为95℃10min后进行40循环95℃10s，60℃10s，70℃10s，每循环在70℃时检测FAM荧光值，完成循环后分析数据与标准品比较得出定量值；所述miRNA-483-5p的PCR引物和探针如表1所示。

表1

在步骤1)中，所述待检测血清可为400μl，所述裂解液的用量可与待检测血清同体积。

在步骤2)中，所述进行定量PCR检测可采用ABI7300定量PCR仪。

本发明建立了全套微量miRNA定量检测体系，包括标准品的合成、引物的设计合成、外参miRNA的选择和关键酶的表达。

与现有的类似方法相比，本发明的突出优点和突出效果如下：

至今，有关血清miRNA的提取与检测方法鲜有报道，本发明系统完整地验证了从引物、探针设计、各种催化酶的使用到外参定量方法，解决了血清中内参不稳定导致定量不准确的弊端，有望将此发明应用于临床，并对今后血清中miRNA作为各种疾病的生物标记这一热门研究起到引导作用。

附图说明

图1为miRNA实时荧光定量PCR标准品曲线(Ath-miR为后面检测时应用的外加的校正参照)。在图1中，横坐标为miRNA标准品加入量(已取10的对数)，纵坐标为核酸对数增长期循环数；标记◆为miR-500a，■为miR-483，▲为Ath-miR-156；Ath-miR-156定量公式：y＝-3.514x+38.65，R²＝0.993；miR-483-5p定量公式：y＝-3.533x+40.71，R²＝0.997；miR-500a定量公式：y＝-3.265x+40.48，R²＝0.994。

图2miRNA-483-5p血清混浆实验结果。在图2中，纵坐标为拷贝/毫升。

图3为血清miRNA-483-5p在乙肝相关性肝癌、慢性乙型肝炎、健康人群中的表达状况(n代表每组病人数)。在图3中，纵坐标为血清miR-483-5p量(log₁₀拷贝/ml)。

具体实施方式

首先应用miRNA芯片技术对乙肝相关性肝癌和年龄、性别配对的非肝癌的乙肝患者的血清miRNA高通量筛选，筛选在在乙肝相关性肝癌高表达的miRNAs，利用建立的定量PCR检测体系并验证血清miR-483-5p。

标准品曲线实验方法可参照http://www.mirbase.org/数据库的已知序列委托核酸合成公司合成miRNA标准品(经特殊化学修饰可防止RNA外切酶的切割，经验证常温稳定放置2月不降解)，计算得出拷贝数并按需要浓度进行稀释作为外参。应用已知浓度的标准品队列，取待检测血清400μl，与同体积裂解液混合，定量RT-PCR方法，验证了检测的良好线性和高灵敏度(参见图1)。