[发明专利]高低密度法分离培养大胚龄人神经干细胞的方法

权利要求书

1.一种高低密度法分离培养大胚龄人神经干细胞的方法，其包括如下步骤：

S1：原代细胞的分离培养：取13周水囊引产的新无菌条件下分离出大脑皮层组织，剥除脑分成小块后在PBS液中漂洗三次洗去血细胞，用细吸管轻柔吹打至组织碎块完全散开，离心洗涤后吹打制成悬液，经200目尼龙滤网过滤，制成单细胞悬液，无血清培养基，台盼蓝染色计数活细胞，调整细胞浓度为1×10⁷/ml，将原代细胞短暂贴壁2次去除成纤维细胞，分别种植于未包被的培养瓶，37℃，5％CO₂条件下静置培养；

S2：神经干细胞的传代培养：原代细胞培养出现大量悬浮克隆球后进行传代培养；

S3.单细胞定点动态观察克隆形成：在贴壁细胞培养法中挑选散在的出现明显增大具有强折光性的细胞，在培养瓶底面用记号笔分别标记，动态定点观察并照相记录；当单个细胞形成克隆球并逐渐增大即将悬浮脱离时，用玻璃微管逐个吸出克隆球进行分化试验；

S4.诱导分化培养：将以上获得的来自单细胞的克隆球用胰酶消化和胎牛血清终止后分别种植于直径3.5cm预先用多聚赖氨酸包被的小培养皿中，用有血清培养基DM EM/F12+5％Fcs进行分化培养；以及

S5.免疫荧光法检测：将上述获得的克隆球种入包被的小培养皿，用无血清培养基贴壁培养12小时后行免疫荧光检测。

2.如权利要求1所述的一种高低密度法分离培养大胚龄人神经干细胞的方法，其中所述步骤1包括悬浮细胞培养法和贴壁培养细胞法。

3.如权利要求2所述的一种高低密度法分离培养大胚龄人神经干细胞的方法，其中所述悬浮细胞培养法是在高细胞密度培养7天后首次换液时重新计数活细胞，以1×10⁵/ml密度分瓶继续培养。

4.如权利要求2所述的一种高低密度法分离培养大胚龄人神经干细胞的方法，其中所述贴壁细胞培养法在每次换液时吸取上悬液离心后加新鲜培养基种入新的培养瓶，原瓶中仅保留贴壁细胞，加入新鲜培养基继续培养。