[发明专利]一种多倍体杨树的筛选方法及其专用引物有效
| 申请号： | 201110446619.1 | 申请日： | 2011-12-28 |
| 公开（公告）号： | CN102533993A | 公开（公告）日： | 2012-07-04 |
| 发明（设计）人： | 李淑娴;尹佟明;戴晓港;渠纪腾;冯凯 | 申请（专利权）人： | 南京林业大学 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12N15/11 |
| 代理公司： | 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204 | 代理人： | 邱兴天 |
| 地址： | 210037 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 多倍体 杨树 筛选 方法 及其 专用 引物 | ||
1.一种多倍体杨树的筛选方法及其专用引物，其特征在于：以待筛选样品的DNA为模板，在特异性微卫星引物的引导下进行PCR扩增获得产物，通过电泳对扩增产物进行基因型分析，检测扩增位点所含等位基因数目，若扩增出的等位基因数目大于或等于3个，则对应样品为多倍体杨树，否则不为多倍体杨树；其中，特异性微卫星引物为以下12对引物中的全部引物：
引物对1：GACACCGTTTCTTTTCTGAG，ACCAGATCTTCATCTTCCAA；
引物对2：TCGAATAGCTGGGATACTTC，TATCACCCGAACAAAAACTC；
引物对3：TTACGATCGCCATTATGAA，TCTTTAACCTCCCCTAAACC；
引物对4：AACCTCCAATACCAAGATCA，TGAGAATAAATATTTCGGCAA；
引物对5：CCTTAGCCTTCTCACACAAC，GGTCTCCATTTTAGCTGTCA；
引物对6：GCCCAAACTCTTATTTGATG，TGGTGGAGGCTAGGATAGTA；
引物对7：ATTGCTCTTGCAGAAATCAT，GGATACCAAGTCATCGGTAG；
引物对8：ATCAATTAGACCGGGTTTTT，TGTTCCAGTTCATGCTGATA；
引物对9：ATTGGTCTCGTACCCAAAA，ATTTCCAATGCATATGTTCC；
引物对10：AGAACTTGTGAGGCAGGTAA，AAAGCTCTCCCCTAACAAAG；
引物对11：TTATTTGGATCCTGAAATGG，GATGGTTCGGTATGTGAGTT；
引物对12：ACAAAATTTTCGCAAGAAAG，TTCTGTTCATGAGAGTGGAA。
2.根据权利要求1所述的多倍体杨树的筛选方法，其特征在于：PCR反应体系为：模板DNA 25ng，未标记的上游引物和FAM标记下游引物各20ng，200uM dNTP，0.5 U Taq聚合酶，1.5uL含100 uM pH 8.3的Tris-HCl、500 mM KCl、20 mM MgCl2和10.0 g /L BSA 的10× buffer，加灭菌去离子水补充反应积到15uL。
3.根据权利要求1所述的多倍体杨树的筛选方法，其特征在于：PCR反应条件为：94℃预变性2min； 94℃变性30s，50℃退火30 s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸5min。
4.根据权利要求1所述的多倍体杨树的筛选方法，其特征在于：基因型分析在ABI3130测序仪上按如下步骤进行：反应产物用灭菌去离子水1：20稀释；取1uL稀释后的反应产物，加9uL上样缓冲液（含91%去离子甲酰胺，9% 450ROX内标）；配制好的上样产物95℃变性5min后，置于冰上迅速冷却，然后上机运行；其中，上样缓冲液含91%体积去离子甲酰胺，含9%体积450ROX内标。
5.根据权利要求1所述的多倍体杨树的筛选方法，其特征在于：所述的多倍体杨树为天然多倍体杨树或杂交育种产生的多倍体杨树。
6.根据权利要求1所述的多倍体杨树的筛选方法，其特征在于：当检测对象为多倍体杨树，如三倍体中若在某一位点检测到3个等位基因，说明该位点等位基因均为杂合；若检测2个等位基因，说明该位点有两个等位基因纯合，另一个为杂合；若只检测1个等位基因，说明该位点3个等位基因均纯合。
7.根据权利要求1所述的多倍体杨树的筛选方法，其特征在于：当检测为二倍体杨树时，二倍体中若在某一位点检测到2个等位基因，说明该位点等位基因杂合；若只检测到1个等位基因，说明该位点2个等位基因纯合。
8.一种权利要求1所述的多倍体杨树的筛选方法的专用引物，其特征在于：所述的专用引物是微卫星引物，为以下12对引物中的全部引物：
引物对1：GACACCGTTTCTTTTCTGAG，ACCAGATCTTCATCTTCCAA；
引物对2：TCGAATAGCTGGGATACTTC，TATCACCCGAACAAAAACTC；
引物对3：TTACGATCGCCATTATGAA，TCTTTAACCTCCCCTAAACC；
引物对4：AACCTCCAATACCAAGATCA，TGAGAATAAATATTTCGGCAA；
引物对5：CCTTAGCCTTCTCACACAAC，GGTCTCCATTTTAGCTGTCA；
引物对6：GCCCAAACTCTTATTTGATG，TGGTGGAGGCTAGGATAGTA；
引物对7：ATTGCTCTTGCAGAAATCAT，GGATACCAAGTCATCGGTAG；
引物对8：ATCAATTAGACCGGGTTTTT，TGTTCCAGTTCATGCTGATA；
引物对9：ATTGGTCTCGTACCCAAAA，ATTTCCAATGCATATGTTCC；
引物对10：AGAACTTGTGAGGCAGGTAA，AAAGCTCTCCCCTAACAAAG；
引物对11：TTATTTGGATCCTGAAATGG，GATGGTTCGGTATGTGAGTT；
引物对12：ACAAAATTTTCGCAAGAAAG，TTCTGTTCATGAGAGTGGAA。
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