[发明专利]空肠弯曲菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体及其包被的免疫磁珠和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及空肠弯曲菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体及其包被的免疫磁珠和应用。

背景技术

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni，C.jejuni)大量存在于各种野生或家养动物的肠道内，污染水源或食物后可引起腹泻的暴发流行，被感染的动物常无明显的症状，并长期携带此菌。目前C.jejuni感染已成为全球范围内急性胃肠炎最常见的病因之一。在发展中国家，它是儿童腹泻死亡的重要病原，也是旅行者腹泻的最常见原因，在美国和其他工业化国家，空肠弯曲杆菌感染引起的腹泻是沙门氏菌、志贺氏菌或大肠杆菌(O157:H7)引起的腹泻的2～7倍。该菌还可引起格林-巴利综合征和儿童急性迟缓性瘫痪。C.jejuni传统分离培养方法的取样量较少，划线培养后，一些杂菌快速摄取培养基中的有效营养成分，严重干扰C.jejuni的分离培养，造成传统分离方法的敏感性和检出率降低；酶联免疫吸附试验(ELESA)、核酸探针杂交、聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR(Real-time PCR)等方法敏感、特异、且检出率较高，但存在一定的非特异性反应，不能区分活菌和死亡细菌。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种空肠弯曲菌特异性表面蛋白多抗原表位串联表达后制备的人工多肽及其特异性抗体。

本发明的另一目的是提供包被有该抗体的免疫磁珠。

本发明的又一目的是提供该免疫磁珠的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

空肠弯曲菌特异性表面蛋白多抗原表位串联表达后制备的人工多肽，是由人工分析空肠弯曲菌特异性表面蛋白的抗原表位，人工设计、改造、串联、表达后获得，其氨基酸序列为SEQ ID No.1，编码所述含空肠弯曲菌特异性表面蛋白多抗原表位的核苷酸序列为SEQ ID No.2。

所述的含空肠弯曲菌特异性多抗原表位的人工多肽的特异性抗体。

由所述的空肠弯曲菌特异性抗体包被的免疫磁珠。

一种利用所述的试剂盒富集检测空肠弯曲菌的方法，按如下步骤进行：

(1)样品的预增菌依据GB/T 4789.9进行，样品加入预增菌培养液后，在微需氧条件(5％氧气、10％二氧化碳、85％氮气)下，以100rpm的振荡速度，36±1℃培养4h；必要时测定增菌液的pH值并调整至7.2±0.2，42±1℃继续培养24h-48h；也可用等效的方法进行预增菌；

(2)取所述预增菌液20-30mL，加入权利要求3所述的免疫磁珠50μL，37℃孵育1h；

(3)将其放于磁力架上，3min后弃去上清，加入30mL PBS缓慢重悬，磁力架吸下免疫磁珠后，弃去上清，如此重复洗涤3次；

(4)吸附后的免疫磁珠直接铺于显色平板上进行分离培养，或直接提取DNA用PCR或荧光PCR进行检测；为避免免疫磁珠上抗体影响菌落的生长状态，可以向吸附后的免疫磁珠中加入1mL 50mmol/L甘氨酸溶液(pH2.0)，间断振荡洗脱1h；将离心管放于磁力架上，待免疫磁珠全部被吸附于管壁上时取出上清，用洗脱下的菌液直接铺于显色平板上进行分离培养，或直接提取DNA后用PCR或荧光PCR进行检测。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明选择空肠弯曲菌4个位于菌体表面的特异性蛋白各选取一个抗原性较强的表位，人工设计出一条空肠弯曲菌特异性多表位人工多肽，并利用纯化的多肽作为抗原免疫新西兰兔，获得的空肠弯曲菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体对空肠弯曲菌具有良好的特异性。与常规方法相比，本发明空肠弯曲菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体包被的免疫磁珠可以从体积较大的样品预增菌液中将空肠弯曲菌富集，极大地提高下一步分离培养或PCR检测的敏感性；并且本发明空肠弯曲菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体包被的免疫磁珠能够特异性地吸附样品预增菌液中空肠弯曲菌，可排除其它杂菌对下一步的分离培养或PCR检测的干扰，以提高空肠弯曲菌的检出率。由于磁珠包被有特异性抗体，富集效果及效率大大提高，磁珠与细菌结合是通过非共价键结合，不会影响空肠弯曲菌的生理和生化特性。

具体实施方式

实施例1空肠弯曲菌特异性多表位人工多肽的制备

1.空肠弯曲菌特异性表面蛋白多抗原表位串联表达后制备的人工多肽(也称空肠弯曲菌多表位抗原，或称C.jejuni多表位抗原重组蛋白，下同)的设计、合成与克隆