[发明专利]一种双链核苷酸序列、含其的重组质粒及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体而言，本发明涉及一种含多克隆位点的双链核苷酸序列，包含该双链核苷酸序列的重组质粒，所述重组质粒的构建方法。

背景技术

miRNA是真核生物中一类长度约为22个碱基的核苷酸，是参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA。成熟的miRNA是由较长的可折叠形成发卡结构的前体转录物经过Dicer酶或类似于Dicer酶的内切核酸酶加工形成的。miRNA基因存在于基因组的间隔区域或者内含子当中，这些小分子的RNA通过碱基配对与靶mRNA序列的3’MTR区结合来调控基因的表达。

目前人们对miRNA的生物合成过程已经了解比较清楚。简单而言，所述合成过程包括：细胞内编码的miRNA的基因首先在RNA聚合酶II的作用下发生转录，从而形成长度约为几百个核苷酸的初级转录产物pri-miRNA；初级转录产物在RNaseIII家族酶——Drosha的参与下被加工成只含60-70nt具有茎环结构的单个miRNA前体pre-miRNA，然后在另一个RNaseIII家族酶——Dicer的参与下，miRNA前体被加工为双链的miRNA，随后接连形成单链成熟的miRNA。miRNA的转录所需的转录酶与蛋白表达所需的转录酶都属于RNA聚合酶II，因此可以使用同一个II型转录启动子。

目前较为常用的miRNA表达载体一般是利用某一特定的miRNA基因的5’-flanking region和3’-flanking region作为克隆位点来连接体外合成发卡形状的miRNA的前体。由于miRNA在基因组中的位置的特殊性，决定了在体外情况下，普通的miRNA表达载体中无法插入外源蛋白进行表达。这就限制了载体的用途。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种用于构建既能够表达miRNA又能够表达蛋白的重组质粒的双链核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供包含所述双链核苷酸序列的重组质粒，该重组质粒既能够表达miRNA又能够表达蛋白。

本发明的又一个目的是提供该重组质粒的构建方法。

本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种双链核苷酸序列，所述核苷酸序列的两条单链核苷酸序列分别如式1和式2所示：

5’-(X)_n1GAGACC(X)_n2TTTAAA(X)_n3GGTCTC(X)_n4-3’(式1)

5’-(Y)_n5GAGACC(Y)_n6TTTAAA(Y)_n7GGTCTC(Y)_n8-3’(式2)

其中，所述式1中的X为A、T、C或G，n1为1至20的整数，n2为1至20的整数，n3为1至20的整数，n4为1至20的整数，条件是(X)_n1、(X)_n2、(X)_n3或(X)_n4均不包含GAGACC、TTTAAA或GGTCTC；

所述式2中的Y为A、T、C或G，n5为1至20的整数，n6为1至20的整数，n7为1至20的整数，n8为1至20的整数，条件是(Y)_n5、(Y)_n6、(Y)_n7或(Y)_n8均不包含GAGACC、TTTAAA或GGTCTC；并且

n2＝n7，(X)_n2与(Y)_n7互补；n3＝n6，(X)_n3与(Y)_n6互补。

优选地，n2和n7为6至20的整数；n3和n6为6至20的整数。

优选地，所述(X)_n1为TGCTG，所述(X)_n4为A；

优选地，所述(Y)_n5为CCTGT，所述(Y)_n8为C。

根据本发明的具体实施方式，所述核苷酸序列的两条单链核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：

(SEQ ID NO.1)：

5’-TGCTGGAGACCGAATTCTTTAAACTGCAGAAGCTTGGTCTCA-3’