[发明专利]筛选和/或分析目标配体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分析方法，具体而言，本发明涉及一种筛选和/或分析目标配体的方法。

背景技术

高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整体系运转的技术体系。

常用的筛选模型都在分子水平和细胞水平，观察的是药物与分子靶点(也称为靶蛋白)的结合作用，能够直接认识药物的基本作用机制。目前这些模型主要集中在受体、酶、通道以及各种细胞反应方面。近年也出现了基因水平的药物筛选模型，使药物筛选模型的范围更为广泛。举例而言，以酶为作用靶的高通量筛选方法，绝大多数是使用放射性或者比色、荧光的方法来直接检测酶活性，从而评价各种待测试的化合物分子对酶活性的影响(抑制或增强)。多数情况下，筛选靶标酶的小分子抑制剂是为发现药物前体分子而广泛采用的途径。

但是高通量筛选方法也具有以下缺点：

1)根据靶蛋白的功能发展一套特定的HTS方法，往往是费时费力的过程。通常需要对测定该蛋白的酶活性的常规生化方法进行很多的改变和优化才能达到建立HTS方法的要求。而且，一旦改换待研究的靶蛋白，就需要重新设计一套HTS方法。

2)HTS筛选体系会产生一定的假阳性结果。例如蛋白质的非特异性聚合、降解会导致其自身活性的改变，产生假阳性的筛选结果。有研究报道，常规HTS技术所得到的候选分子其中60-80％能够被其他独立的技术所确认，剩余的20-40％的结果无法被重复；对于形式较复杂的HTS筛选体系，只有25％的结果可以被其他技术所重现和确认。

3)HTS技术通常筛选的对象是纯化的化合物单体。如果带测试的对象为混合物(例如天然产物粗分得到的不同组分)，则给出的数据代表的是多组分共同干扰酶活性的整体结果，单由这一结果无法得知是混合物中的何种成分真正起到作用。

蛋白质复合物晶体结构解析是在原子层面上获得关于蛋白质复合物的三维结构信息的技术手段。通常需要得到蛋白质复合物的晶体，而后使用X射线衍射技术解析其三维结构。一旦该方法成功得应用于待研究的靶蛋白和药物分子，便能够详细得了解药物分子与靶标蛋白结合作用的分子机制。

对于待筛选的化合物分子，可将它与靶蛋白的晶体浸泡之后形成共晶(即复合物的晶体)，而后解析该复合物的三维结构，准确得了解配体分子的结合位点和结合的空间模式。

但是蛋白质复合物晶体结构解析方法具有以下缺点：

1)整个实验流程周期长，成本高。对于靶蛋白及其复合物，摸索合适的结晶条件往往需要几个月甚至几年的努力，消耗大量的人力物力；在许多情况下，无论如何优化实验条件都难以得到需要的蛋白质晶体。

2)通常情况下，这一技术仅用于分析与单一的配体(同靶蛋白结合的任何分子都称为配体)有结合作用的蛋白质，要求配体分子达到很高的纯度。因此，对于筛选由天然产物/中药提取出的组成复杂的混合物，必须进行多步纯化得到近乎单一的组分，才能使用该方法逐一得研究特定的小分子化合物和靶蛋白的结合作用。

因此，需要发展一种普适性高，能够排除HTS的假阳性结果，以及能够适用于含有多种小分子化合物的混合物(例如天然产物提取物的初级分离产物)的分析配体和靶蛋白之间的结合作用的方法。

发明内容

为了解决现有问题，本发明提供了一种普适性高，能够排除HTS的假阳性结果，以及能够适用于含有多种小分子化合物的混合物的分析配体和靶蛋白之间的结合作用的方法。

根据本发明的一个方面，本发明提供的分析方法包括以下步骤：

1)对靶蛋白进行纯化

由于通过生物工程技术制备的靶蛋白的溶液不适用于直接的质谱分析，我们首先需要对该蛋白质溶液进行缓冲液的置换，去除其中所含的对质谱分析有严重干扰性的盐类小分子。该步骤可以使用离心式浓缩管、微透析或者微型色谱柱来实现。

优选的靶蛋白是特定病毒合成的蛋白酶(例如HIV蛋白酶和SARS冠状病毒主蛋白酶)或核酸内切酶，该蛋白靶标对病毒的繁殖和侵袭宿主具有关键作用。

2)利用高通量酶活性测试系统筛选出对靶蛋白的活性具有抑制效果的候选抑制剂