[发明专利]含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌的用途

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物领域，涉及含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌在提高2-酮基-L-古龙酸混菌发酵性能中的应用。

背景技术

氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌混菌发酵体系广泛用于维生素C的工业生产中，用于将L-山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸。但该两菌体系中，只有氧化葡糖杆菌能够完成糖酸转化，但其单独培养时生长及其缓慢，产酸效率很低；而巨大芽孢杆菌作为促进氧化葡糖杆菌生长的伴生菌可以提高氧化葡糖杆菌的生长速率和产酸效率。因此提高氧化葡糖杆菌自身的糖酸转化能力是提高混菌发酵生产效率的关键。

分子生物学操作和代谢工程手段加快了菌株人工进化、能够快速提高菌株特性，可以基于基因信息有目的地高效改造菌株。专利CN1621518和专利CN1515669获得了氧化葡糖杆菌进行糖酸转化的关键酶——山梨酮脱氢酶的核酸序列。基于该信息可以对氧化葡糖杆菌进行分子水平改造，进而提高其与巨大芽孢杆菌混合发酵时的2-酮基-L-古龙酸混菌发酵性能。

发明内容

本发明的目的是通过代谢工程的手段来改造氧化葡糖杆菌，增加其山梨酮脱氢酶基因的拷贝数，提高氧化葡糖杆菌与巨大芽孢杆菌混菌发酵转化L-山梨糖为2-酮基-L-古龙酸的性能，提供一种含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌的用途。

本发明的技术方案概述如下：

含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌的用途，是将含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌接种到发酵培养基中，培养，获得2-酮基-L-古龙酸。

所述含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌的构建为：

(1)山梨酮脱氢酶基因的体外扩增：

采用细菌基因组提取试剂盒提取氧化葡糖杆菌基因组为模板；以SEQ ID No.1所示序列为上游引物，以SEQ ID No.2所示序列为下游引物，进行PCR扩增，回收如SEQ ID No.3所示的PCR扩增产物；

(2)编码山梨酮脱氢酶基因载体的构建：

取步骤(1)获得的PCR扩增产物用HindIII酶和BamHI酶双酶切；取载体pBBR1用KpnI酶和HindIII酶双酶切；连接，转化入大肠杆菌DH5α中，获得编码山梨酮脱氢酶基因载体；(3)氧化葡糖杆菌的转化：

取步骤(2)所得编码山梨酮脱氢酶基因载体在1800V条件下电击转化入氧化葡糖杆菌，获得含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌。

将含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌接种到发酵培养基中，使含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌的密度为4×10⁸cfu/ml，使巨大芽孢杆菌的密度为4×10⁸cfu/ml，培养条件为在30℃，250rpm条件下培养120h，获得2-酮基-L-古龙酸；

所述发酵培养基为：按比例称取L-山梨糖80g，玉米浆20g，尿素12g，KH₂PO₄1g，MgSO₄0.5g，CaCO₃1g，加水至1L，调pH为7.0，121℃灭菌20min。

实验证明含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌接种到发酵培养基中，培养发酵，可以使L-山梨糖生产2-酮基-L-古龙酸的糖酸转化率提高。

附图说明

图1为含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌混菌发酵结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。下面的内容及实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不用于限制本发明。

本发明所使用的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)保藏编号为CGMCC No.1.110，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)保藏编号为CGMCC No 1.459，从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)购得。

实施例1

含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌的构建：

(1)山梨酮脱氢酶基因的体外扩增：