[发明专利]一种人羊膜间充质干细胞的分离纯化及鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种人羊膜间充质干细胞的分离、纯化及鉴定方法。

背景技术

人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSCs）发源于胚胎早期的胚外中胚层，具有与骨髓间充质干细胞相似的表型，如表达SSEA-4、 OCT-4、CD29、CD44、CD73、CD90、CD166及波形蛋白，而不表达CD34、CD45、CD80、CD86及HLA-DR；具有多系分化潜能，在适宜诱导条件下可分化成肝细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞心肌细胞、、胰岛细胞、神经元样细胞等；具有来源广泛，取材方便、无侵入性伤害、不牵涉医学伦理问题等优势，因此，hAMSCs作为供体细胞资源在再生医学领域具有广泛的应用前景。此外，MSCs还具有免疫调节作用，在器官移植、血液系统疾病和自身免疫性疾病的临床治疗领域显现出优于传统治疗的独特价值。

hAMSCs的制备过程涉及hAMSCs的分离、纯化、鉴定、体外培养扩增等技术环节。目前关于hAMSCs的分离、纯化、鉴定尚无统一方案。hAMSCs的分离方法有胰蛋白酶-胶原酶液化、胶原酶-中性蛋白酶、羊膜片贴壁培养分离等方法，酶消化法相对简便，而贴壁培养分离较为烦琐且收率不高。各家在采用胰蛋白酶-胶原酶液化法分离hAMSCs时所用胰蛋白酶和胶原酶的浓度、消化温度、消化时间等条件各不相同，分离效果（收率）存在较大差异，迄今尚无具有统计学意义的每份人羊膜的hAMSCs收率数据。hAMSCs的纯化方法多采用原始分离样品贴壁培养。hAMSCs的鉴定主要根据其表型特征通过高能量流式细胞术、免疫组织化学染色、免疫荧光检测hAMCs标志物，如CD14、CD29、CD34、CD44、、CD45 、CD90、HLA-DR、SSEA-4 、OCT-4等；少数采用逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）检测其相关基因及全能性相关基因表达，如LEFTYA、Cripto、Sox2、Nanog、Oct-4、ACTG2、ACTA2 、MMP2等。目前不仅缺乏统一的 hAMSCs鉴定标准，而且存在诸多问题：①受检样品不一致，原代和传代细胞的表型标志不尽相同；②hAMCs与羊膜上皮细胞的阳性标志物有交叉，如CD44、 CD90 、SSEA-4 、OCT-4等，阴性标志物也有交叉如CD14、CD34、 CD45、 HLA-DR等，单凭这些标志物的检测不能区分hAMCs与羊膜上皮细胞；③有的检测方法如原位免疫组织化学染色和免疫荧光染色不能反映细胞群体的标志特征，有的检测方法如PCR较为繁琐且成本较高。

鉴于上述存在的问题，本发明提供了一种人羊膜间充质干细胞的分离、纯化及鉴定方法，是一种高丰度、高纯度、高活力的分离方法、简便而明确的鉴定指标和适宜的体外扩增培养方案。

发明内容

本发明解决的技术问题是：现有技术存在的问题，本发明提供了一种高收率、高纯度、高活力的人羊膜间充质干细胞分离、纯化方法以及简便、准确的人羊膜间充质干细胞鉴定方法。

本发明采用的技术方案为： 

本发明的人羊膜间充质干细胞的分离，包括以下步骤：

第一，无菌采集人足月剖宫产胎盘，机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D-Hank’ s液冲洗数次以清除残留血迹，将羊膜剪成碎片；

第二，羊膜碎片加入含EDTA的胰蛋白酶消化溶液旋转消化10分钟，弃上清；重新加入消化液，旋转消化弃上清，留取未消化的羊膜碎片；

第三，D-Hank’s液冲洗未消化的羊膜碎片，加入含有DNase I的胶原酶，旋转消化至组织完全消化，300目钢网过滤，收集细胞滤液，离心，收集细胞沉淀，得到原始的人羊膜间充质干细胞；

第四，将分离的原始的人羊膜间充质干细胞重新悬浮于LG-DMEM培养基（购自Gibco公司，货号：31600-026）中，将细胞密度接种于6孔培养板，置于CO₂培养箱培养，在倒置显微镜下除去完全未贴壁生长的羊膜上皮细胞，第3天更换新的培养基；待细胞汇合度达80~90%后，用胰蛋白酶—EDTA溶液消化，加入培养基终止胰蛋白酶作用，离心弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮，以1×10⁷/L的细胞密度传代。

本发明的人羊膜间充质干细胞的鉴定方法，包括以下步骤：