[发明专利]一种人羊膜间充质干细胞的分离纯化及鉴定方法

权利要求书

1.一种人羊膜间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：

第一，无菌采集人足月剖宫产胎盘，机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D-Hank’ s液冲洗数次以清除残留血迹，将羊膜剪成碎片；

第二，羊膜碎片加入含0.02%EDTA的0.05%胰蛋白酶消化溶液，于37°C，旋转消化弃上清；重新加入消化液，于37°C旋转消化弃上清，留取未消化的羊膜碎片；

第三，D-Hank’s液冲洗未消化的羊膜碎片，加入含有0.075 mg/ml DNase I的0.75 mg/ml的胶原酶，于37°C，旋转消化约2 h至组织完全消化，300目钢网过滤，收集细胞滤液，离心得到原始的人羊膜间充质干细胞；

第四，将分离的原始的人羊膜间充质干细胞重新悬浮于LG-DMEM培养基中，将细胞密度接种于6孔培养板，置于CO₂培养箱培养，在倒置显微镜下除去完全未贴壁生长的羊膜上皮细胞，第3天更换新的培养基；待细胞汇合度达80~90%后，用胰蛋白酶—EDTA溶液消化，加入培养基终止胰蛋白酶作用，离心弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮，以1×10⁷/L的细胞密度传代。

2.根据权利要求1所述的一种人羊膜间充质干细胞的分离纯化方法得到的人羊膜间充质干细胞的鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：

第一，免疫细胞化学染色：人羊膜间充质干细胞爬片用PBS 缓冲液漂洗，多聚甲醛固定，PBS漂洗，Triton-X100作用15~20 min，H₂O₂灭活内源性过氧化物酶，PBS漂洗，加正常羊血清封闭，滴加波形蛋白抗体或鼠抗人CK19抗体室温孵育，PBS漂洗，滴加鼠兔通用型二抗室温孵育，PBS漂洗，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封固，光学显微镜下观察，阴性对照组用PBS替代一抗；

第二，流式细胞术分析 ：调整人羊膜间充质干细胞密度为1×10⁶/ml，每管200 ??L细胞悬液，共3管，分别加入各20??L荧光标记单抗CD29-PE+CD44-FITC、CD34-PE+CD45-FITC和CD166-PE，混匀，室温避光孵育，每管加2 ml含1 g/L NaN₃的磷酸盐缓冲液，混匀，离心弃上清，振荡悬浮细胞，每管加入10 g/L多聚甲醛300 ??L，混匀，用流式细胞仪检测，用Cell Quest软件进行采集分析，用小鼠IgG-FITC或IgG-PE作为同型对照。