[发明专利]一种斑马鱼胚胎DNA错配修复功能活性的分析方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物学技术领域，涉及一种斑马鱼胚胎DNA错配修复功能活性的分析方法，以及此分析方法在环境化合物DNA错配修复功能毒性评价上的应用。

背景技术

DNA错配修复(mismatch repair，MMR)系统广泛存在于生物体中，它是DNA复制后的一种修复方式。其功能是修复DNA在复制过程中引入的错配、插入或缺失突变，使DNA序列恢复正常。因此，它起着增强DNA复制保真度、修复DNA错配、降低基因变异和维持基因组稳定性的作用。DNA错配修复功能一旦减弱或缺失，机体非常容易产生突变，进而诱发突变表型产生癌变。因此，定量分析DNA MMR功能活性是预防癌症、进行药物癌症风险评价的一种重要手段。

目前，分析DNA错配修复功能活性的方法有很多，主要有以噬菌体M13mp2及其衍生株为材料，通过噬菌斑变化来定量的方法；有以人工合成寡聚核苷酸为材料，通过限制性内切酶位点变化来定量的方法；有以EGFP基因作为报告基因，通过相对绿色荧光蛋白变化来定量的方法。前两种方法以细胞核提取物来进行MMR功能活性评价，属于体外分析法，存在操作过程复杂，指示参数灵敏度低和准确度低及不易统计等缺点。后一种方法是由美国德州大学孙鲁浙(Lu zhe-Sun)教授首次提出(Lei，X.；Zhu，Y.；Tomkinson，A.；Sun，L.，Measurement of DNA mismatch repair activity in live cells.Nucleic Acids Res 2004，32，(12)，e100.)，并经过一些优化与改进(Zhou，B.；Huang，C.；Yang，J.；Lu，J.；Dong，Q.；Sun，L.Z.，Preparation of heteroduplex enhanced green fluorescent protein plasmid for in vivo mismatch repair activity assay.Anal Biochem 2009，388，(1)，167-9.Zhou，B.；Dong，Q.；Ma，R.；Chen，Y.；Yang，J.；Sun，L.Z.；Huang，C.，Rapid isolation of highly pure single-stranded DNA from phagemids.Anal Biochem2009，389，(2)，177-9.中国专利申请号：201010586301.9，一种双荧光质粒、基于其的活细胞内DNA错配修复功能活性的分析方法及其应用)，在操作过程与精度方面较之于前两种方法有了很大的进步，但是这三种方法对DNA MMR功能活性的定量均只限于在细胞水平上，很难准确真实的反映生物体内MMR功能活性的强弱变化。因此，建立一种用于机体水平上进行DNA MMR功能活性分析的方法，并将其用于环境化合物或药物的致癌风险评价具有十分重大的现实意义。

斑马鱼是一种热带淡水鱼，最初被用于发育生物学和遗传学研究。由于斑马鱼有着独特的优势特征：体型小、易饲养繁殖、体外受精、卵生且产卵量大、胚胎透明、胚胎发育快、性成熟期短、与人类基因高度同源、污染物和药物可以直接加入胚胎培养液中，斑马鱼现已成为研究大分子物质生物活性的一种重要动物模型。

随着绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)转基因技术成功的在斑马鱼模型上的应用，使用斑马鱼模型，尤其是绿色荧光蛋白转基因斑马鱼胚胎模型来定性定量研究体内大分子物质的生物活性成为了一种可能。与其他动物模型相比，转基因斑马鱼胚胎模型有着经济、快速、方便及高效等优势。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种操作简单、直观有效度量的斑马鱼胚胎DNA错配修复功能活性的分析方法以及此方法在评价环境化合物DNA错配修复功能毒性上的应用，以克服传统DNA错配修复功能活性分析方法仅局限于细胞内，不能真实、准确地反映整体水平上DNA错配修复功能活性的不足。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种斑马鱼胚胎DNA错配修复功能活性的分析方法，所述分析方法包括以下步骤：

1)以质粒pGEM-EGFP制备单链DNA分子，所述质粒pGEM-EGFP能正常表达绿色荧光蛋白；