[发明专利]单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定方法及PNA探针

权利要求书

1.单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）的肽核酸原位荧光鉴定用PNA探针，其特征在于：该PNA探针的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

2.单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1）离心收集对数生长期的细菌，用PBS洗涤一次，再用PBS调整菌液浓度至OD₆₀₀=0.5-2.0；

2）取10μl 菌液于98%酒精清洗过的玻片上涂匀，火焰固定，将玻片于80%的酒精中浸泡15分钟，风干；

3）25μl含500pmole/mlPNA探针的杂交缓冲液，PNA探针的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，滴加于玻片上，55℃作用1-1.5小时，杂交后玻片于55℃预热的洗涤缓冲液中洗涤2次，每次10分钟；

4）取2～5μl菌液涂片，风干后显微镜观察其荧光亮度及细菌的形态。

3.根据权利要求2所述的单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定方法，其特征在于：杂交缓冲液，pH7.5，该杂交缓冲液包括10%（w/v）硫酸葡聚糖，10 mM NaCl，30% (v/v)甲酰胺，0.1%（w/v）焦磷酸钠，0.2%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮，0.2%（w/v）聚蔗糖，5 mM Na₂EDTA，0.2% (v/v) TritonX-100和50 mM Tris/HCl。

4.根据权利要求2所述的单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定方法，其特征在于：洗涤缓冲液，pH10，该洗涤缓冲液包括5 mM Tris，15mM NaCl和0.1% (v/v) TritonX-100。