[发明专利]一种信号增强型免疫层析金标试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于食品安全、检验检疫、环境检测以及疾病早期诊断用的金标试纸条技术领域，具体涉及一种信号增强型超灵敏胶体金标记免疫层析试纸条及其制备方法。

背景技术

随着社会的发展和国际进出口贸易量的增加，检验检疫以及食品安全检测所面临的检测任务越来越重，海量检测样品量对检验检疫和食品安全检测提出了新的需求。传统依靠仪器的检测方法具有检测灵敏度高，检测结果稳定性好等优点。但由于大型仪器具有价格昂贵，操作人员必须具有相关的专业知识，以及检测成本昂贵等缺点决定了依靠大型仪器的检测方法不能够在各种基层和现场检测中广泛推广使用。基于免疫分析技术的检测方法在一定程度上缓解了当前检测所面临的严峻形势。如酶联免疫吸附分析法，具有检测灵敏度高，检测成本相对低廉等特点。胶体金检测试纸条的出现对于检测时间上有了极大的革新，在小于1小时的时间范围内实现目标物的快速检测。同时，由于金标试纸条检测技术在检测过程中不需要其他复杂的仪器，只需通过肉眼观察即可判断试纸条的检测结果。在这样的条件下，试纸条的检测灵敏度对于检测结果的判断具有重要意义。但金标试纸条发展至今，其检测灵敏度的优化一直是试纸条相关检测方法的研究重点之一。

发明内容

本发明针对现有金标试纸条及其相关检测方法的灵敏度有待进一步提高的研究现状，利用纳米材料的比表面效应，进行金标试纸条检测信号增强的研究，提供了一种信号增强型免疫层析金标试纸条及其制备方法，实现对目标检测物进行超灵敏现场快速检测。

本发明具体的技术方案如下：

一种信号增强型超灵敏免疫层析金标试纸条包括塑料衬板，所述塑料衬板上分别依次粘贴有样品玻璃纤维膜，免疫探针金标垫，信号扩增金标垫，硝酸纤维膜和吸水玻璃纤维膜五种粘贴物；相邻粘贴物之间重叠部分的长度为2 mm，干燥封装，温度4℃～常温条件下保存。

一种信号增强型免疫层析金标试纸条的制备方法的具体制备操作步骤如下：

（1）目标检测物金标免疫探针的制备

选取粒径为30～40nm的胶体金溶液，用浓度为0.1 M的碳酸钾（K₂CO₃）溶液调节胶体金溶液的pH值至8.5～9.5，得调节后胶体金溶液A；

将浓度为1mg～2 mg /mL的兔抗目标检测物抗体溶液与浓度为1 mg～2 mg /mL的牛血清白蛋白（BSA）溶液以摩尔比1：100混合，得混合溶液；

取混合溶液10 μL加入到1 mL调节后胶体金溶液A中，室温下振荡反应15min； 

在温度4℃条件下，以10000 rpm的速度离心20 min，去除上清未结合的抗体和牛血清白蛋白（BSA）；

将离心得到的沉淀重新分散于磷酸缓冲溶液（PBS）中，得到目标检测物金标免疫探针；（2）金标信号扩增探针的制备

选取粒径为15～20 nm的胶体金溶液，用浓度为0.1 M的碳酸钾（K₂CO₃）溶液调节胶体金溶液的pH值至8.5～9.5，得调节后胶体金溶液B；

以1：1000～1：3000的标记比例将浓度为1mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）抗体溶液加入到调节后胶体金溶液B中，室温下反应15min；温度4℃条件下，以10000 rpm的速度离心20 min后，去除上清中未结合的牛血清白蛋白（BSA）抗体；

将离心得到的沉淀重新分散于磷酸缓冲溶液（PBS）中，得到金标信号扩增探针；

（3）目标检测物免疫探针金标垫和目标检测物信号扩增金标垫的制备

将目标检测物金标免疫探针和金标信号扩增探针分别喷涂到两块玻璃纤维膜上，得到目标检测物免疫探针金标垫和目标检测物信号扩增金标垫；

（4）具有检测线和参照线的硝酸纤维膜的制备

在一块硝酸纤维膜上用浓度为1mg/mL的目标检测物-卵清蛋白偶联物溶液和浓度为1mg/mL的羊抗兔抗体溶液分别画两条线平行的线，目标检测物-卵清蛋白偶联物划线作为检测线，羊抗兔抗体溶液划线为参照线；

（5）信号增强型免疫层析金标试纸条的制备

将样品玻璃纤维膜、目标检测物免疫探针金标垫、目标检测物信号扩增金标垫、具有检测线和参照线的硝酸纤维膜和吸水玻璃纤维膜五种粘贴物分别依次粘贴到塑料衬板上；相邻粘贴物之间的重叠部分的长度为2 mm，得到信号增强型超灵敏检测金标试纸条，干燥封装，温度4℃～常温条件下保存。

所述步骤1中的兔抗目标检测物抗体为兔抗双酚A抗体，兔抗邻苯二甲酸酯抗体或兔抗莱科多巴胺抗体。