[发明专利]利用基因工程技术获得无种子植株的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种利用基因工程技术获得无种子植株的方法及其应用；具体地说，本发明是利用NapinB(油菜种子中的一个主要储藏蛋白)基因启动子控制的Barnase(核糖核酸酶)基因表达，构建载体转化植物获得无种子性状的方法；其应用是基于该方法产生无种子植株并保持植株的无种子特性不因窜粉杂交而改变。

背景技术

无籽育种是瓜果育种的一个重要方向，现在已经有很多无籽水果投放市场，如无籽西瓜、无籽葡萄、无籽猕猴桃等。目前，市场上的无籽水果大部分都是通过培育三倍体或诱导单性结实形式获得。

近年来，随着生物技术的发展，利用基因工程手段研制无籽作物成为可能。与培育三倍体或诱导单性结实相比，使用基因工程手段获得的无籽植物，克服了传统无籽育种周期长、代价高等缺点。目前，使用转基因技术获得无籽植株的研究主要集中在利用外源基因直接或协同表达调节植物生长素，进而诱导单性结实，获得无籽果实；或利用种皮特异表达meganuclease(大范围核酸酶)等活细胞毒素基因产生无籽果实。但是，这些方法一般都是通过杂交获得，培育时间相对较长。且使用外源基因控制植物激素表达，由于外源基因的插入位点以及表达量很难控制，很难达到百分之百的单性结实，而且具有单性结实的植株需要去雄或与雄性不育系配套才能获得无籽果实。

Barnase是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)产生的一种胞外RNA酶，其编码区长330bp，编码一条含110个氨基酸残基的肽链。同时，在淀粉芽孢杆菌基因组中还含有一个长273bp编码Barnase特异性拮抗蛋白Barstar的基因，其产物能与Barnase以一比一的比例结合，从而使细菌表达的Barnase失去酶活性。作为一种小分子的RNA酶，Barnase在细胞中的表达可以导致胞内RNA的非特异性降解，从而表现为强烈的细胞毒性，其在特异细胞中的表达通常都会导致宿主细胞死亡。利用这一特性，Barnase已经被用于诸如控制肿瘤细胞的再生以及病毒复制等领域。

在转基因植物领域，Barnase基因最为重要和最为成功的应用还是通过控制其在花粉绒毡层中的特异表达抑制花粉的发育，而获得转基因植物雄性不育系。Mariani等通过构建花粉绒毡层特异启动子pTA29调控Barnase基因表达的转化载体(pTA29-Barnase)，并转化到烟草、甘蓝型油菜、莴苣、番茄、棉花、玉米、花椰菜和菊苣等植物中，培育了转基因雄性不育系。然后将转基因雄性不育系与转Barstar基因的转基因恢复系植株杂交，其F1代花粉恢复育性。现在，通过组合使用转化Barnase基因的雄性不育系、转Barstar基因的育性恢复系和非转基因受体育性保持系，已经成功实现了三系配套的杂交育种。目前，含有Barnase基因的转基因作物已经在多个国家被批准商业化种植和销售，如商业化的转基因杂交油菜杂交品种MS1×RF1、MS1×RF2和MS8×RF3。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的上述缺点和不足，提供一种利用基因工程技术获得无种子植株的方法及其应用。利用该方法获得的无种子植物的无种子特性不会因为外来花粉的窜粉杂交而改变，而且，该品种作为杂交亲本与任何品系杂交都无种子形成，使得转基因作物的生物安全性大大增加。

本发明的目的是这样实现的：

1、利用基因工程技术获得无种子植物的方法

本方法包括下列步骤：

①克隆或合成种子特异性表达油菜NapinB基因启动子；

②克隆或合成核糖核酸酶Barnase基因片段；

③克隆或合成宿主植物肌动蛋白Actin基因内含子；

④构建以含有内含子的Barnase基因为靶序列的遗传转化载体(如图1)；

⑤转化并筛选转基因植株(如图2)；

⑥检测转化株自交种子发育情况(如图3)；

⑦检测转化株与非转化株杂交种子发育情况。

2、利用基因工程技术获得无种子植株的方法的应用

本方法的应用是：

①利用以NapinB基因启动子控制Barnase基因表达的遗传转化载体转化植物获得无种子转化株；

②利用以上方法获得的无种子转化株为亲本与非转化株进行杂交，获得无种子性状植物。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和积极效果：

①本发明可以转化有种子植物获得无种子性状；

②本发明获得的转基因品种作亲本可以与任何亲本(包括种子正常发育亲本)杂交获得无种子杂种；