[发明专利]一株2-酮基-D-葡萄糖酸高产菌株的筛选方法及该菌株的发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及一株2-酮基-D-葡萄糖酸高产菌株的筛选方法，以及用该菌株发酵生产2-酮 基-D-葡萄糖酸的方法。

背景技术

2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid，2KGA)，是目前大规模生产的有机酸之一， 主要用于食品抗氧化剂D-异抗坏血酸钠(sodium erthorbate，EN)以及D-异抗坏血酸(erythorbic  acid，EA)的合成，D-异抗坏血酸又称异维生素C，在食品工业上被广泛用为食品抗氧化剂。 2KGA的生产方法主要有酶法、化学合成法、发酵法3种，目前工业中主要采用细菌发酵法 生产。

国内外2KGA发酵通常采用假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌，尤其是荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens)。通常以淀粉水解糖作为碳源，玉米浆作为氮源，控制pH6.0-7.0。 在较高的溶氧条件下，添加18％左右的葡萄糖，温度维持在28-30℃，葡萄糖转化率在80％ 以上，发酵周期60h左右。由于该发酵是一个产酸过程，需要在培养基中添加3-5％的CaCO₃， 也可以用NaOH、氨气、氨水代替CaCO₃。而将沙雷氏菌作为发酵菌种在国内很少有见报道。

国内目前生产2KGA主要采用分批发酵，初始葡萄糖浓度一般不超过18％，因为葡萄糖 浓度过高，发酵周期将延长，转化率也降低。有关补料发酵生产2KGA的工艺也有报道，用 氨水代替CaCO₃，可以将葡萄糖的浓度提高到30％左右。

同时我国国内发酵生产2KGA也存在一些问题：噬菌体污染严重；发酵周期偏长；发酵 生产效率不高，能源消耗高于国外同类型企业。

发明内容

本发明提供一株2-酮基-D-葡萄糖酸高生产菌及其筛选方法和用该菌株发酵生产2-酮基 -D-葡萄糖酸，发酵周期比文献报道缩短12h左右，显著提高了生产强度。

本发明的技术方案：

1、一种产2-酮基-D-葡萄糖酸沙雷氏菌的筛选方法：

1)沙雷氏菌的初步分离纯化

在江南大学食品与科学国家重点实验室附近采集土样，称取约0.2g土壤于20ml 0.85％ 无菌生理盐水中，振荡混匀之后将菌悬液涂布至5％盐浓度的牛肉膏蛋白胨培养基上30℃培养 36h，将产紫红色素的菌落作为进一步筛选的疑似菌株，编号保存；

2)产2-酮基-D-葡萄糖酸沙雷氏菌的筛选

将上述分离纯化得到的菌种接种于5％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基中，培养36h后离心 收集发酵液，发酵液采用内标法经高效液相色谱进行定性分析，使得2-酮基-D-葡萄糖酸钙 标准品峰高增高的菌株即为产2-酮基-D-葡萄糖酸的沙雷氏菌。

2、根据权利要求1所述一种产2-酮基-D-葡萄糖酸沙雷氏菌的筛选方法，其筛选得到产 2-酮基-D-葡萄糖酸的沙雷氏菌的鉴定方法如下：

1)形态学鉴定

菌落形态、细胞形态、革兰氏染色；

2)生理生化鉴定(见表1)

3)16S rDNA分子生物学鉴定

用细菌基因组提取试剂盒提取细菌基因组DNA，采用通用引物进行PCR扩增，扩增产物 用胶回收试剂盒回收纯化，并连接至克隆载体pMD 18T Vector，转化到大肠杆菌JM109中， 利用克隆载体的青霉素抗性筛选到阳性转化子，并用通用引物对转化子进行质粒PCR鉴定。

阳性克隆测序所得16S rDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行同源性分析，得 到与之亲缘关系最近的菌种Serratia sp，同源性达99％。

通过形态学、生理生化及16S rDNA分子生物学鉴定确定该菌株为沙雷氏菌，并命名为 Serratia sp.FMME043。

3、本发明公开的一种2-酮基-D-葡萄糖酸的高产菌种，其特征是采用Serratia sp.FMME043 为出发菌株，以种子培养和液体发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸；

1)种子培养：

种子培养基以g/L计：牛肉浸取物3，蛋白胨5，NaCl 5，初始PH 6.8-7.2；

培养条件：温度30℃、摇床转速200rpm条件下，培养11-12h；

2)液体发酵培养：