[发明专利]假型淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒糖蛋白的慢病毒载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种假型淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒糖蛋白的慢病毒载体，属于分子生物技术领域。

背景技术

逆转录病毒载体在新技术中的应用越来越多，例如基因工程中的基因转移、医学研究以及基因治疗等领域(例如：C.Baum等人1998年在Gerson & Lattime学术出版社出版的《肿瘤学术讨论：基因治疗对于癌症，翻译方法从临床前期研究到临床实施》)。大部分逆转录病毒是来源于小鼠白血病病毒(MLV)。他们含有保持病毒完整性必需的所有LTR区序列以及负责包装功能的Ψ元件。而编码病毒蛋白的区域则被替换为研究人员想要转入人类细胞的外来基因以及控制序列。这些载体在辅助细胞系(也称为包装细胞系)中表达，这些细胞含有逆转录病毒基因组的完整拷贝。上述细胞系能够合成病毒复制和感染所需的所有蛋白，但是由于它们缺乏Ψ元件，所以不能将病毒的基因组RNA包装到病毒蛋白颗粒中。如果逆转录病毒载体插入到辅助细胞基因组中并发生转录，含有Ψ元件的转基因mRNA能够形成并与辅助病毒蛋白作用，然后被包装到病毒颗粒中。不含病毒任何遗传信息的重组病毒颗粒通过它们的表面蛋白被细胞吸收。病毒衣壳在细胞质中被分解，而转基因RNA被转换为双链DNA并整合到宿主细胞基因组中。这一系统的优势在于基因的整合能够通过细胞分裂稳定地遗传给下一代细胞。而它的劣势在于整合的位点是随机的。

逆转录病毒载体采用一种稳定的共轭整合(比如说：不对载体基因组序列进行重组和重排)，从而使转入的基因能够长期表达。除上述方法外，目前能够做到基因长期表达的只有游离疱疹病毒载体和腺病毒载体(AAV载体)。而后者的包装系统(包装细胞系)还没有得到优化。此外，腺病毒载体包装能力较弱(腺病毒载体大概能包装5kb遗传信息，而逆转录病毒载体能包装10-12kb)。

除了被转移的基因外，包装系统还表达含有逆转录病毒顺式元件的载体基因组。载体基因组的转录并不能编码逆转录病毒的蛋白，而是在gag-、pol-和env-基因产物的帮助下形成一个有侵袭能力但不能自我复制的病毒，插入到包装细胞系中。这一病毒能够作为逆转录病毒载体，将转移整合到载体基因组中的基因至目标细胞中，而不会在目标细胞中出现新的载体复制现象。换句话说，病毒载体只能感染目标细胞但是不会在目标细胞中进一步复制。

逆转录病毒包装系统的开发已经有了很大成果并能在GMP条件下大量生产不具备病毒复制能力的载体上清。基于小鼠白血病病毒的载体(MLV vectors)已经多次用于临床试验(P.Chu et al.，J.Mol.Med.76(1998)184-192).

两种基本的逆转录病毒包装体系在之前的文献中已经有报道(J.M.Wilson，Clin.Exp.Immunol.107 Suppl.1(1997)31-32；C.Baum et al.1998)，loc cit.)。

MLV包装细胞系含有逆转录基因gag(图1)，但是pol和env基因以及包装逆转录病毒RNA需要的序列被敲除了(C.Baum et al.，(1998)，loc.cit.)。

另一种已知的包装系统来源于慢病毒(R.Carroll et al.，J.Virol.68(1994)6047-6051；P.Corbeau et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)14070-14075；L.Naldini et al.，Science 272(1996)263-267；C.Parolin et al.，J.Virol.68(1994)3888-3895；J.Reiser et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)15266-15271；J.H.Richardson et al.，J.Gen.Virol.76(1995)691-696；T.Shimada et al.，J.Clin.Invest.88(1991)1043-1047).慢病毒是一种复杂的逆转录病毒，它除了表达gag，pol和env基因产物外还表达一系列调控基因。现有慢病毒包装系统主要来源于人免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。慢病毒包装系统的组成与MLV载体大致相同。