[发明专利]一种猪伪狂犬病毒天然弱毒株C株及其耐热保存方法

说明书

技术领域

本发明属于动物用病毒活疫苗制造领域，尤其是涉及一种猪伪狂犬病毒天然弱毒株C株及其耐热保存方法。 

背景技术

伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)是一种a-疱疹病毒，可引起多种家畜和野生动物的伪狂犬病。除猪以外的其它动物表现为致死性感染，猪是PRV的天然宿主和贮存宿主，呈流行性感染。成年猪常常表现为隐性感染和呼吸道症状，母猪流产、产死胎和木乃伊胎，公猪表现为睾丸炎。仔猪表现出发热、昏迷和神经症状，死亡率很高。因此，伪狂犬病是养猪业的一种重要的传染病。 

目前，弱毒活疫苗是预防畜禽传染病的主要疫苗之一，在我国动物用疫苗中，活疫苗占相当大的比例。但是目前的疫苗毒株大多是人工致弱，这样存在着毒株返强、免疫后虽然可以减轻发病症状、减少死亡率，但是不能阻止野毒的潜伏感染。天然弱毒株的发现会对控制甚至净化猪伪狂犬病开创新的篇章。 

国内疫苗企业常用的保护剂主要是蔗糖、牛奶、明胶等，组方简单，保护性能差。如果在2℃～8℃条件下，保存期只有3～6个月，多需要在-15℃以下保存。而国内传统的动物用疫苗保护剂的研制相对滞后，使疫苗的长期保存和长途运输受到很大限制，加上基层防疫部门缺乏必要的冷冻和冷藏设施，容易因免疫失败而造成疫病流行。所以，耐热保护剂的研究非常急需，发达国家在二十世纪八十年代就已开始进行耐热保护剂的研究，目前已经基本采用耐热冻干保护剂生产冻干疫苗，但由于保护剂的研究和应用属于专利资料，处于保密状况中。 

当前，进入中国市场的伪狂犬疫苗均是采用耐热保护剂冷冻的而成，存放温度在2～8℃，存放时间甚至长达30个月，很好的保证了疫苗的使用效果。而我国的伪狂犬活疫苗存放温度仍然是-15℃，进口疫苗对国产疫苗造成了巨大的市场冲击，影响国内生物制品企业的发展。技术的落后也限制了国产疫苗海外市场的拓展。耐 热型疫苗的研发势在必行。 

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供猪伪狂犬病毒天然弱毒株C株，其微生物保藏号是：CCTCC NO：V201114；保藏时间：2011年7月20日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心，CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION(CCTCC)；保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。 

本发明猪伪狂犬病毒天然弱毒C株的基因序列缺失全部的gE和部分的gI。 

本发明采用细胞培养、PCR、测序、动物试验等一系列手段研究了猪伪狂犬病毒C株的生物学特性、稳定性、安全性，试验结果表明，该毒株在鸡成纤维细胞CEF上生长良好，对猪是安全的，有很好的稳定性，在连续回传动物5代，都很稳定，不发生变异，为猪伪狂犬弱毒疫苗的研制提供了很好的资源。 

一种猪伪狂犬病毒天然弱毒株C株的耐热保存方法，包括以下步骤： 

(1)按照以下组分及重量百分比含量备料： 

明胶1～3％、蔗糖6～8％、牛血清白蛋白1～3％、胰蛋白胨2～3％、EDTA1～3％、谷氨酸单钠1～3％、磷酸氢二钾1～2％、磷酸二氢钾0.52％，余量为双蒸水； 

(2)耐热保护剂的配制： 

将明胶、蔗糖、EDTA、胰蛋白胨按上述配比溶于双蒸水中，108～121℃高压灭菌15～30分钟；将牛血清白蛋白、谷氨酸单钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾按上述配比溶于双蒸水中，用0.22μm的滤膜除菌，然后将两种耐热保护剂组份混合，配制成耐热保护剂； 

(3)病毒保存： 

将该耐热保护剂和伪狂犬病毒培养液根据需要按1∶1.2混合，然后进行冻干； 

(4)冻干工艺： 

将分装好的病毒装入冻干机箱体内，在2～3小时内缓慢降温至-45℃，在此温度下维持5～6个小时后，开始抽真空至10^-4帕后，在开始升温，14～16小时内升至-20℃，之后以每小时2～5℃的速度升温至20℃，维持5～6小时加塞出箱，冻干全程为42～46个小时。 

在2～8℃条件下保存24个月，病毒效价下降保持在1个滴度内。 

与现有技术相比，本发明具有以下优点： 

(1)研究了猪伪狂犬病毒C株的生物学特性、稳定性、安全性，试验结果表明，该毒株在鸡成纤维细胞CEF上生长良好，对猪是安全的，有很好的稳定性，在连续回传动物5代，基因序列稳定，没有发生变异，为猪伪狂犬弱毒疫苗的研制提供了很好的资源。