[发明专利]一种对重金属铜高度敏感的生物传感器的制备方法及其产品

权利要求书

1.一种对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：

(1)利用条件复制质粒pKD46和pCP20，利用Red重组系统，敲除野生型大肠杆菌E.coli MC4100基因组中copA、cueO和cusA三个基因，构建ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA三基因突变菌株；

(2)利用交叉PCR技术构建含有报告基因gfpmut2与大肠杆菌copA基因启动子PcopA及转录终止子SoxS相融合的融合报告基因PcopA::gfpmut2；

(3)将步骤2所得片段克隆到pMD18-T载体上，构建PcopA::gfpmut2-T重组载体；

(4)测序分析正确的重组载体PcopA::gfpmut2-T经双酶切切下目的条带连接到pET28a载体上，构建融合报告载体PcopA::gfpmut2-pET28a；

(5)将步骤(4)所得融合报告载体转入步骤1构建的ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA三基因突变菌株。

2.根据权利要求1所述对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤(1)中ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA三基因突变菌株的制备依次包括有如下步骤：1、引物信息及合成；2、单突变菌ΔcopA的制备；3、双突变菌ΔcopA-ΔcueO的制备；4、三突变菌ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA的制备；其中上述步骤2中的单突变菌ΔcopA的制备具体是：一、pKD46/MC4100菌株制备；二、带FRT位点的cat基因PCR扩增；三、pKD46/MC4100电转感受态细胞的制备；四、电转化cat基因；五、cat基因的PCR鉴定；六、pCP20的转化；七、cat抗性基因的消除；八、ΔcopA单突变菌的纯化。

3.根据权利要求1或2所述对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器的制备方法，其特征在于：所述的报告基因选用选用编码增强型绿色荧光蛋白的gfpmut2基因，融合报告基因PcopA::gfpmut2的制备依次包括有如下步骤：1、引物信息及合成；2、E.coli MC4100细菌基因组DNA的提取；3、PCR扩增PcopA；4、PCR扩增gfpmut2-soxSCo基因；5、交叉PCR获得融合报告基因PcopA::gfpmut2；6、PCR产物胶回收。

4.根据权利要求1或2所述对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器的制备方法，其特征在于：融合报告载体PcopA::gfpmut2-pET28a制备依次包括有如下步骤：(一)试剂盒提取质粒pET28a；(二)pET28a质粒的双酶切及其回收；(三)目的片断与载体的连接反应；(四)将连接好的重组质粒转入DH5α感受态细胞中；(五)阳性克隆的鉴定。

5.根据权利要求3所述对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器的制备方法，其特征在于：融合报告载体PcopA::gfpmut2-pET28a制备依次包括有如下步骤：(一)试剂盒提取质粒pET28a；(二)pET28a质粒的双酶切及其回收；(三)目的片断与载体的连接反应；(四)将连接好的重组质粒转入DH5α感受态细胞中；(五)阳性克隆的鉴定。

6.按照上述制备方法得到的对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器，其特征在于：由野生型大肠杆菌E.coli MC4100缺失copA、cueO和cusA三个基因，并转入融合报告载体PcopA::gfpmut2-pET28a。