[发明专利]一种从长双歧杆菌NQ-1501中提取完整肽聚糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从长双歧杆菌NQ-1501中提取完整肽聚糖的方法，尤其涉及一种应用化学方法提取来自益生菌的完整肽聚糖的方法。

背景技术

癌症是威胁人类生命的重要疾病之一。世界卫生组织和各国政府的卫生部门都把攻克癌症作为一项重要的工作。研究开发新型、高效的抗肿瘤新药不仅具有良好的经济效益，更会带来巨大的社会效益。一般情况下，抗肿瘤药物因原料稀少或科技含量较高价格都很昂贵，因此研究生产出一种疗效显著、价格低廉的抗癌药物是社会所需。

国内外学者经过研究明确阐明长双歧杆菌是生理性有益菌，它对维持人体健康起重要的作用，包括：生物学屏蔽、合成多种维生素、控制内毒素血症、抑制腐败细菌、致病菌在肠道中生长繁殖，提供营养，提高机体免疫力、预防和治疗与抗生素有关的腹泻、便秘、抗肿瘤、预防癌变、抗感染等。在以小鼠为模型的研究中表明长双歧杆菌对肝癌、结肠癌、乳腺癌及艾氏腹水瘤等肿瘤具有一定的抑制作用。接下来的研究证明长双歧杆菌的抑制肿瘤活性与其细胞壁中的完整肽聚糖密切相关，同时作为提取自长双歧杆菌细胞壁的天然产物，其不会有任何毒副作用

关于完整肽聚糖的提取方法已有文献报道，最早也是最为广泛的提取方法是1985年Sekine研究两歧双歧杆菌对荷瘤小鼠肿瘤凋亡试验，从热处理过的婴儿双歧杆菌(B.infantis Reuter)中分离得到三种化学物质，经形态鉴定它们分别是具有生物活性的细胞壁制剂。分别是：1)经超声波处理后的细胞破碎样中提取出的细胞壁成分(CWS)；2)从完整细菌细胞分离、不经过物理破碎、保持完整性的细菌细胞壁结构的物质(WPG)；3)用超声波处理过的WPG，他们分别用这三种物质给荷瘤小鼠皮下注射，研究这三种经过不同方法提取的物理形态不同的细胞壁制剂的抗肿瘤效果，结果发现这三种制剂都有不用程度的抑瘤效果，只有CWS没有肿瘤凋亡活性。肿瘤凋亡活性证明细胞壁物理形态的完整程度与抑瘤作用大小成正相关性，完整程度高，活性就高，而抑瘤作用大小也与细胞壁的完整程度有关。Sekine等人的这个试验为后人对双歧杆菌细胞壁结构的完整性与其抗肿瘤作用的相关性提供了有力的依据，物理结构上具有完整性的细胞壁制剂也可能成为一种高效的体内抗肿瘤药物。

1997年国内的乐军和胡宏首次用自己培养的双歧杆菌1101采用Sekine等人创立的提取双歧杆菌完整肽聚糖的方法成功提取出此菌的完整肽聚糖，此后国内很多关于双歧杆菌完整肽聚糖所需样品都由他们实验室提供。1998年国内孟凡伦等参照Park等人提取肽聚糖的方法从SB900乳酸链球菌中提取出其细胞壁成分肽聚糖。2005年宋晓玲等在孟凡伦试验方法的基础上加以改进，在实验室提取出双歧杆菌(Bifidobacterium thermopHilum)的肽聚糖粗产品，采用此法一天即可由细菌培养物中获取粗制肽聚糖。尽管他们用的方法比较简单，时间短，但是所提取出的肽聚糖并不是完整肽聚糖。

总结上述几种提取肽聚糖的方法，采用Sekine等人建立的复合酶法提取双歧杆菌完整肽聚糖，由于条件温和整个纯化过程中不使用任何物理和化学方法，能够得到细胞骨架完整的肽聚糖。因为双歧杆菌的很多功能都与其细胞壁的完整性有关，特别是其抑制肿瘤作用和细胞凋亡活性功能，所以用这种方法提取的双歧杆菌常用于肽聚糖结构、组分分析和生物学功能的研究。但这种方法的缺点是试验步骤繁琐、耗时长，一套流程结束至少需要2周以上的时间，在处理的过程中极容易污染，不能用于大规模的工业化生产。而采用孟凡伦和宋晓玲等的三氯化乙酸裂解法制备的肽聚糖虽然具有制备方法简单，步骤少，制备周期短，1-3天即可从细菌培养物中获取粗制肽聚糖的优点，但制备的肽聚糖空间结构被破坏，其细胞壁骨架外形不再为袋状结构而呈皱褶紧缩状，而且用此方法制得的完整肽聚糖纯度较低。因此完整肽聚糖一直因为提取方法没有突破而不能应用于大规模生产，因而也只能局限于实验室研究。

而本发明制备完整肽聚糖的方法由于条件温和，且整个纯化过程中不使用任何物理与化学方法破坏细胞壁的骨架结构，因此分离得到了细胞骨架完整的肽聚糖，通过透射电镜观察所提取到的细胞骨架呈袋状结构，这与Sekine所报道的一致，但Sekine法制备的肽聚糖虽然也完整，但因其周期长、步骤繁多，极易在提取过程中受到污染，仅停留在实验室提取完整肽聚糖阶段。孟凡伦也曾采用TCA提取肽聚糖，其制备方法和步骤简单，制备周期仅为3天，但因其TCA作用时间略长，所提取物是破坏了细胞壁完整结构的粗肽聚糖，呈皱褶紧缩状。