[发明专利]一种猪CAR激动剂的高通量筛选方法

权利要求书

1.一种猪CAR激动剂的高通量筛选方法，其特征在于，方法如下：

第一步：猪肝脏总RNA提取，RT-PCR扩增出pgCAR基因片段：

将冻存于液氮中的猪肝脏组织在始终有液氮存在的研钵中进行研磨，将研磨成粉末状的肝脏组织进行总RNA提取，总RNA提取试剂盒购自Bioteke公司；

将提取出的总RNA进行反转录，反转录试剂盒购自Applied Biosystems公司，形成cDNA；根据pgCAR的序列设计两段引物：

上游：5’-CCC AAG CTT GCC ATG GCC AGC GGG GAA GA-3’，

下游：5’-CGC GGA TCC TCA GCT GCA GAT CTC CTG GA-3’，

将其稀释到20μM；以反转录后的cDNA为模板进行目的基因的扩增，总体积为25μl，PCR体系为：

扩增酶购自TaKaRa公司，将PCR产物克隆到购自TaKaRa公司的载体pMD18-T中，形成质粒T-CAR进行测序；测序结果显示扩增出的pgCAR序列为：

atggccagcg gggaagatga gccaaggaac tgtgctgtgt gcggggaccg agccacaggc

tatcacttcc atgccttgac ttgtgagggc tgcaagggtt tcttcaggcg aacagtcaac

aaaagcacca gtctcatctg cccctttgct ggaagctgta aggtcaataa ggcccagagg

cgccactgcc cagcctgcag gttgcagaag tgcctagatg ctggcatgaa gaaagacatg

atcctatcag cagaagtcct ggcattgcgg cgagcaagac aggttcagcg ccgggcacag

caagcatcac tgcagctgag taaggagcag aaggcgttag tccagatact cctgggggcc

catacccgcc atatgggcac tatgtttgat cagtttgtgc agttcaggcc tccagctcat

ctgttcatcc atcaccagca cttgccaccc ctggtgcctg aactgtctct gctcatgcat

ttcgcggaca tcaacacttt catgatacag caaattatca agttcaccaa ggatctgccc

ctcttccggt ccctgcccat ggaggaccag atctcccttc tcaagggagc agctgtagaa

atttgtcaga tcgtactcaa taccactttc tgtctgcaaa cacaaaaatt cctctgtggg

cctcttcgct acacaataga agatggagcg catgtggggt tccaggaaga gtttttggag

ttgctctttg gcttccataa gacacttcgg cgactgcagc tccaggagcc tgagtatgtg

ctcatggttg ctgtggccct cttctctcct gaccggcctg gggtaaccca gaggaaggag

attgatcagt tgcaagagga gatggcactg actctgcaga gctacatcaa agggcagcag

ccaagtctcc gggacaggtt tctctatgca aagctgctgg gcctattggc tgagctccga

agcattaaca aagaatactg gtaccaaatc cagaacatcc agggactgtc caccatgatg

ccgctgctcc aggagatctg cagctga

第二步：将pgCAR基因片段与真核表达质粒连接：

通过Hind III和购自TaKaRa公司的BamH I酶双酶切T-CAR质粒得到pgCAR目的片段，再亚克隆到用Hind III和BamH I酶双酶切过的(购自Invitrogen公司的pcDNA3.1(+)真核表达质粒上，连接酶购自TaKaRa公司，最终构建成pcDNA3.1-CAR重组表达质粒；

第三步：NR1响应元件五联体和(NR1)₅-TK promotor全基因合成，并与报告质粒连接：

(NR1)₅-TK全基因序列为：

agatctgatc actgtacttt cctgaccttg gatcgatcac tgtactttcc tgaccttgga

tcgatcactg tactttcctg accttggatc gatcactgta ctttcctgac cttggatcga

tcactgtact ttcctgacct tggatcggcc ccgcccagcg tcttgtcatt ggcgaattcg

aacacgcaga tgcagtcggg gcggcgcggt ccgaggtcca cttcgcatat taaggtgacg

cgtgtggcct cgaacaccga gcgaccctgc agcgacccgc ttaacagcgt caacagcgtg

ccgcaagctt

序列两边加入BglII和HindIII两酶切位点，以便与报告质粒连接，此片段合成插入到pUC57载体中；通过BglII和HindIII双酶切pUC57-(NR1)₅-TK重组载体，得到(NR1)₅-TK片段，再亚克隆到用BglII和HindIII酶双酶切过的购自promega公司的萤火虫荧光素酶报告载体PGL3-promotor vector上，最终构成重组报告质粒PGL3-(NR1)₅-TK；

第四步：将重组表达质粒、重组报告质粒及内参报告质粒共转染哺乳动物细胞形成稳定细胞株：

将均购自Gibco公司的三种试剂：DMEM细胞培养液、胎牛血清和双抗，按其体积比为DMEM∶胎牛血清∶双抗＝89∶10∶1的比例制成混合细胞培养液A，将购自sigma公司的HepG2细胞加入到混合细胞培养液A中，然后将该混合细胞培养液A置于37℃并含有体积浓度为5％ CO₂的细胞培养箱中培养，待细胞融合度达到80-90％时，用胰酶消化，将均购自Gibco公司的DMEM细胞培养液和胎牛血清，按其体积比为DMEM∶胎牛血清＝9∶1制成细胞培养液B，再用新鲜的混合细胞培养液B洗一次，然后在96孔板上几种细胞，每孔200μl 5×10⁵个细胞，细胞培养24h后进行转染，质粒按pcDNA3.1-CAR∶PGL3-(NR1)₅-TK∶PRL-TK＝2∶1∶1进行转染，方法参照购自Sigma公司的PEI转染试剂的说明书进行，24小时后，换液传代培养；

第五步：在稳定细胞株中加入待筛选的药物，测定报告基因的表达水平，评估药物的生物活性：

将带筛选药物加入到转染后的稳定细胞中，经过24h培养，用1×PBS漂洗再用购自Promega公司的Dual-Reporter Assay System双荧光素酶报告基因监测系统进行荧光测定，评估药物的生物活性；

第六步：将生物活性高的药物选出，得到pgCAR激动剂。