[发明专利]一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统及其应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域。具体涉及一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统及其应用。 

背景技术

 口服抗原递呈系统因其具有接种简单，价格便宜的优点，被广泛地应用于多种感染性疾病疫苗开发。目前已经过临床试验的口服疫苗包括：霍乱疫苗（Arakawa T等，1998，Nat Biotechnol 16: 292-297）、脊髓灰质炎疫苗（Huang QS等，2005，Lancet 366:394-396）、伤寒疫苗（Levine MM等，2007，Clin Infect Dis 45 Suppl 1: S24-28）等。目前，用于口服疫苗抗原的投递载体包括脂质体（Minato S等，2003，J Control Release 89: 189-197），细菌芽孢（Cutting SM等，2009，Int Rev Immunol 28: 487-505.）、可生物降解的大分子颗粒（Yeh MK等，2002，J Control Release 82: 237-247），减毒细菌（Huang JM等，2003，Vaccine 28: 7523-7528）等。其中，减毒沙门氏菌是应用的最为广泛的细菌口服疫苗载体，它是一种天然的粘膜免疫佐剂、抗原表达和投递工具，通过基因工程改造的重组疫苗株可以将外源抗原分子或DNA运送给巨噬细胞、树突状细胞等抗原递呈细胞，并通过组织相容性复合体MHC-Ⅰ或MHC-Ⅱ途径递呈给T细胞,并激发机体产生针对抗原分子的细胞、体液以及粘膜免疫应答。

与其它口服疫苗载体相比，以减毒沙门氏菌做为疫苗抗原载体具有以下独特的优点：1）能够使抗原分子主要经过胞内途径递呈给MHC-Ⅰ分子，而使机体产生针对抗原的一型（Type-1）细胞免疫反应：这一特点很好地解决了直接接种重组蛋白而不能较好地激起细胞免疫反应，从而使疫苗保护性效果不佳的难题；2）无法比拟的低成本特性：细菌本身就是抗原分子的生产工厂与输送工具，而细菌的培养与扩增条件简单并易于控制。与其它方式的抗原疫苗形式相比，大大地减少了重组抗原的生产、修饰、加工、运输等成本；3）低风险性：口服减毒细菌，被抗原递呈细胞摄取后，在胞内完成抗原的表达与输送后，它们可以较快地被机体清楚，安全可靠，应用价值可观。 

但是开发一种高效、应用性强的口服减毒沙门氏菌疫苗，需要面临以下技术难题：a） 重组细菌的表型稳定性。利用减毒细菌作为外源抗原的表达工具，需要建立一种合适的表达策略，以优化抗原表达量与质粒兼容性，因为质粒表达往往存在质粒丢失而引起的表型不稳定的问题；b）抗原分子的分泌问题，因为细菌进入抗原递呈细胞后寄生在一种膜包裹的囊泡结构之中，这种结构在很大程度的限制了抗原分子的有效递呈（Zhang XL等，2008，Cell Mol Immunol. 5(2):91-97）。 

    学者们尝试不同的分泌信号与抗原分子偶联以实现抗原的分泌，其中最为有效的是Ⅲ型分泌系统。自Russmann H等1998年在Science上首次报道了利用沙门氏菌Ⅲ型分泌系统投递抗原分子可以打破囊泡膜结构对抗原递呈的限制，为减毒沙门氏菌载体的口服疫苗开发提供了一种新的有效的思路以来。学者们利用Ⅲ型分泌系统效应分子如SopE（沙门氏菌外膜蛋白E），YopE（耶尔森氏菌外膜蛋白E）或其分泌信号与抗原分子融合表达，实现了抗原分子的有效递呈，并在治疗性肿瘤疫苗开发中展示了一定的前景（Russmann H等，2003，Adv Exp Med Bio 529:407-413；Nishikawa H等，2006，J Clin Invest116:1946-1954；Zhu X等，2010，Cancer Sci 101:2621-2628）。在以Ⅲ型分泌系统为抗原投递策略的研究中，学者们都是利用组成性表达启动子（PsopE或Plac，）（Nishikawa H等，2006，J Clin Invest116:1946-54；Zhu X等，2010，Cancer Sci 101:2621-2628；Emeka等，2002，Infection and Immunity 7114–7119）来调控抗原分子的表达。然而最近的研究表明组成性表达启动子会造成质粒的丢失，使抗原在体内不能持续表达，而不能有效的激活机体针对抗原分子的免疫反应（Xu等，2010，Infect Immun 78(11) :4828-4838）。