[发明专利]使用编码双链启动子一条链的引物的方法

权利要求书

1.用于制备对应于靶核酸中的靶序列的转录产物的方法，该方法包括：

(a)获得靶核酸；

(b)获得有义启动子引物，该有义启动子引物包括含有有义转录启动子的5′-端部分以及互补于靶的3′-端部分；

(c)使有义启动子引物与靶核酸退火，以形成靶核酸-有义启动子引物复合体；

(d)使靶核酸-有义启动子引物复合体与DNA聚合酶在聚合反应条件下接触，以获得互补于靶序列的第一链cDNA；

(e)获得第一链cDNA；

(f)在连接条件下连接第一链cDNA，以获得含有义启动子的环形第一链cDNA；

(g)获得反义启动子寡核苷酸；

(h)使反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的环形第一链cDNA退火，以获得环形转录底物；

(i)获得环形转录底物；和

(j)使环形转录底物与RNA聚合酶在转录条件下接触，其中获得转录产物。

2.根据权利要求1的方法，其中反义启动子寡核苷酸包含固定在固相支持物上的寡核苷酸。

3.用于在或从样品中检测被分析物的方法，该方法包括：

a)获得被分析物结合物质-寡核苷酸(″ABS-oligo″)，其中ABS-oligo包含连接于寡核苷酸的ABS，所述寡核苷酸包含双链启动子中对于识别该启动子的RNA聚合酶而言为反义启动子部分的序列；

b)获得信号探针，其中信号探针包含连接于模板3′-端的有义启动子，其中有义启动子与ABS-oligo的反义启动子充分互补以形成复合体，通过使用与该复合体结合的RNA聚合酶，该复合体可用于所述模板的转录；

c)使ABS-oligo与假如样品中存在被分析物则被分析物结合于其上的表面在被分析物结合条件下进行接触，所述条件允许假使被分析物存在的话，该ABS-oligo结合所述表面上的被分析物；

d)在允许除去未结合的ABS-oligo的条件下洗涤表面；

e)使表面与信号探针在允许该信号探针与假使存在的话在表面上的ABS-oligo复合的复合条件下进行接触；

f)任选地，在允许除去未结合的信号探针的条件下洗涤表面；

g)使表面与RNA聚合酶在允许使用ABS-oligo与信号探针之间的复合体转录由模板编码的产物的条件下进行接触；和

h)如果存在的话，检测由模板编码的转录产物。

4.用于扩增模板互补性转录产物的量的方法，该方法包括：

a)获得转录产物；

b)获得包含互补于转录产物3′-端的3′-端部分以及任选的位于其5′-端上的磷酸酯基团或拓扑异构酶部分的有义启动子引物；

c)使有义启动子引物与转录产物退火；

d)用RNA-依赖性DNA聚合酶在DNA合成条件下对与转录产物退火的启动子引物进行引物延伸，以获得第一链cDNA；

e)任选地，去除与第一链cDNA退火的RNA；

f)连接第一链cDNA，其中5′-端共价连接于第一链cDNA的3′-端，以获得含有义启动子的环形第一链cDNA；

g)使反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的环形第一链cDNA退火，以获得用于转录的环形底物；

h)使用于转录的环形底物与RNA聚合酶在转录条件下进行接触，以获得附加的转录产物；和

i)获得所述附加转录产物。

5.权利要求4的方法，其中有义启动子引物包含从由为RNA聚合酶所用以产生附加转录产物的假启动子或合成启动子组成的组中选择的单链有义启动子，并且其中不使用反义启动子来获得附加的转录产物。

6.权利要求4的方法，其中有义启动子引物包含N4启动子，而用于转录的RNA聚合酶选自N4vRNAP、mini-vRNAP以及突变的mini-vRNAP，并且其中不使用反义启动子来获得附加的转录产物。