[发明专利]磷化蛋白的电化学免疫传感器

说明书

技术领域

本发明涉及LPA-p53¹⁵Ab₂-CNS纳米复合材料制备方法，以及结合高灵敏的阳极溶出伏安法和纳米载体放大技术测定样品中磷化蛋白phospho-p53¹⁵的浓度。

背景技术

P53蛋白是调控人体内细胞生长和监控细胞分裂时DNA的复制最重要的分子，它是一种重要的肿瘤抑制基因，能防止癌变，还能帮助细胞基因修复缺陷。但当人体受到紫外光照射或化学致癌物的作用时，p53不能执行上述功能时，对细胞的增殖失去控制，往往就会导致细胞发生癌变。据报道超过一半的人体癌细胞中，肿瘤抑制因子p53蛋白都有不同形式和程度的受损现象。人类的p53蛋白是由393个氨基酸残基组成的，有4个结构域，它的磷酸化过程主要发生在几个丝氨酸残基上。大多数癌症患者的基因突变都发生在p53蛋白的中间部分。据有关的研究报道指出，15号位丝氨酸的磷酸化可作为γ-辐射暴露的潜在生物标志物，受γ射线照射越严重，15号位丝氨酸的磷酸化就越严重，也就是磷化蛋白phospho-p53¹⁵的浓度越高。因此，磷化蛋白phospho-p53¹⁵可以作为人体受γ-辐射暴露的潜在生物标志物。而现在很少有文献报道检测人体癌细胞中phospho-p53¹⁵的含量，所以发展一种快速、高灵敏的分析方法来检测磷化蛋白phospho-p53¹⁵的含量对癌症患者的早期临床诊断具有十分重要的意义。

迄今为止，传统检测磷化蛋白phospho-p53¹⁵的方法是酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。该方法虽然准确，且能实现高通量检测，但是它包含多次温育和洗涤步骤，后续的分光光度检测还需要专门的底物显色剂，而且需要昂贵的仪器、专业的实验室和训练有素的专业技术人员，不利于现场检测以及基层使用的推广普及。所以现在急需发展一种简单、快速、高灵敏度的分析方法实现磷化蛋白phospho-p53¹⁵的快速检测。与ELISA相比，基于电化学检测的免疫技术是一种检测生物标志物的有效方法，它具有操作简单，所需样品量少等优点，结合纳米信号放大技术，可以实现磷化蛋白phospho-p53¹⁵的高灵敏度检测。

发明内容

本发明的目的是为检测磷化蛋白提供一种高灵敏、低成本、简单快速的电化学免疫传感器，即提供一种磷化蛋白phospho-p53¹⁵的电化学免疫检测方法，

本发明的技术方案：

一种磷化蛋白phospho-p53¹⁵的电化学免疫检测方法：

第1步：免疫反应：分别取25μL MPs-p53¹⁵Ab₁放置于10个容积1.5mL的塑料离心管中，然后在上述10个塑料离心管分别加入25μL浓度为0.02ng/mL，0.05ng/mL，0.1ng/mL，0.2ng/mL，0.5ng/mL，1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，10ng/mL，20ng/mL的phospho-p53¹⁵，在磁力搅拌器上搅拌反应50分钟后，磁性分离；用磷酸缓冲溶液(PBS)反复洗涤后，再分别加入50μL的LPA-p53¹⁵Ab₂-CNS，反应40分钟，磁性分离和洗涤3遍。

第2步：阳极溶出伏安测定。向离心管中加入10μL浓度1.0M盐酸，使Pb²⁺从LPA的内腔中释放出来；然后加入50μL含0.5mg/L Bi的醋酸缓冲溶液，醋酸缓冲溶液浓度0.2M，pH为4.6，混合2分钟之后，磁性分离磁性纳米粒子(MPs)；取50μL上层清液滴在印刷电极表面，先在-0.9V富集2分钟，然后从-0.9-0.3V记录SWV曲线，电位增量4mV，振幅25mV，频率15Hz；在-0.56V得到铅离子的溶出伏安峰。通过检测磷酸铅-去铁铁蛋白(LPA)中包裹的pb²⁺的阳极溶出信号测定样品中磷化蛋白phospho-p53¹⁵的含量。

上述本发明的检测方法步骤1)中，所用的MPs-p53¹⁵Ab₁的制备方法：