[发明专利]靶向人血管紧张素原的RNA干扰片段、表达载体与应用

说明书

技术领域

本发明涉及RNA干扰片段及应用领域，具体是涉及靶向人血管紧张素原（angiotensinogen，AGT）的RNA干扰片段及其应用。

背景技术

肥胖是人类非常常见的病症，肥胖者体内脂肪细胞含量高出正常水平较多。而现有减肥的主要方向是降低体内脂肪含量。若能通过基因手段，抑制脂肪细胞的形成，则将有效抵制肥胖的形成。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供靶向人血管紧张素原的RNA干扰片段，以抑制人前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化，从而抑制肥胖的形成。

本发明进一步所要解决的技术问题是，提供一种针对人血管紧张素原的RNAi片段构建的表达载体。

本发明进一步所要解决的技术问题是，提供一种上述RNA干扰序列及其表达载体的应用，以抵制肥胖的形成。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种针对人前脂肪细胞内血管紧张素原的RNA干扰片段，其具有以下任一序列：

R1：TCCTGGGTGTTCCTTGGAA

R2：CTGGATGTTGCTGCTGAGA。

又一方面，本发明还提供一种RNA干扰片段的表达载体，该表达载体具有如上所述的RNA干扰片段。

进一步地，该表达载体具有SEQ ID NO：1或2所示的序列。

另一方面，本发明还提供以上任一项在抑制肥胖中的应用，利用所述RNA干扰片段抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化，从而降低脂肪细胞含量，抑制肥胖形成。

本发明的有益效果如下：经实验证明，本发明设计的二种干扰质粒都能降低HPA-v细胞中人血管紧张素原的表达，各干扰减低人血管紧张素原mRNA表达量约35%以上，蛋白水平表达量约47.6%。同时脂肪细胞分化程度降低，这表明针对人血管紧张素原的RNAi序列能够抑制脂肪细胞的分化，可抑制脂肪的形成。因此本发明所涉及的干扰片段及表达载体可用于抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化，降低脂肪细胞含量，抑制肥胖形成的用途。

附图说明

图1A~图1C分别是本发明构建的三个重组表达载体PR1、PR2、PR0的示意图。

图2分别是本发明的PR1、PR2的RNAi表达载体测序结果图，图中，曲线1、2、3、4分别代表碱基G、C、T、A。

图3是本发明的定量PCR扩增图。

图4为本发明抑制脂肪细胞AGT表达的电泳检测结果。

图5至图7显示本发明抑制脂肪细胞分化程度的检测结果。

图8是HPA-v转染重组质粒后分化过程中脂质含量的变化曲线图。

图9是本发明转染重组质粒对人前脂肪细胞分化过程中GPDH活性的影响对比图。

具体实施方式

下面通过具体实施例并参照附图对本发明进行更详细的说明。应该理解的是，以下所述的实施例仅是用于说明而不是限制本发明。

实施例一     RNAi片段的设计

从国际开发共享基因库（NCBI Genebank）中查找出人AGTmRNA序列（基因ID NM 000029）。然后，再根据Tuschl和Reynolds等提出的siRNA设计原则，并且借助于Ambion公司所提供的在线siRNA设计软件siRNA Target finder（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNAfinder.htmL）来确定靶序列，筛选2条19bp长的靶序列，分别为R1，R2。为避免siRNA非特异性抑制同源性较高的其它基因，利用BLAST软件（http://www.ncbinlm.nih.gov/blast），对备选靶序列同源性分析，确保无非特异性沉默。此外，还设计一条不针对任何基因的19bp的序列R0，作为阴性对照。三条序列具体如下：

R1：TCCTGGGTGTTCCTTGGAA

R2：CTGGATGTTGCTGCTGAGA

R0：ACGCTGAGTACTTCGAAAT

以上三条序列均送由生工生物工程（上海）有限公司合成。

实施例二     RNAi表达载体的构建