[发明专利]长效重组人生长激素的Fc融合蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地，本发明涉及一种长效重组人生长激素的Fc融合蛋白及其制法和用途。

背景技术

人生长激素(hGH)是由脑下垂体产生和释放，全长191个氨基酸、分子量为22kDa的肽类激素。它参与了大部分人的正常生长和发育的调控，是刺激身体生长的主要激素，并呈现出多种生物效应，包括线性增长、体质形成、泌乳、巨噬细胞活化以及类似胰岛素作用等。此外，生长激素还可以刺激骨骼、软骨和肌肉的代谢。

生长激素与其特异生长激素受体(hGHR)在靶点细胞表面相互结合，介导出生化串联反应，从而激活生物效应。生长激素与受体分子的结合通常遵循一种序贯机制；先通过生长激素内的结合位点1与第一个受体分子结合，其后再通过生长激素的结合位点2与第二个受体分子结合。这种由一个生长激素分子与两个生长激素受体分子的结合是激化生物活性、调节生长和发育所必需的步骤。具体地，结合位点2包含了生长激素分子N端的8个氨基酸和其他几个来自属于螺旋线1和螺旋线3内的氨基酸。结合位点1则包括生长激素分子在螺旋线1之内的氨基酸以及C-端附近的氨基酸。结合位点1的8个氨基酸占了结合总能量的85％。换言之，这8个氨基酸在与受体结合的过程中扮演了决定性的角色。若将这8个氨基酸残基的位置以其它氨基酸取代，将会迅速改变其与生长激素受体结合的能力(例如见，Wells et al.Recent Prog.Horm.Res.，48：253-75，1993)。这8种氨基酸位于螺旋线1和螺旋线2之间段(K41，L45，P61，R64)和螺旋线4内的羧基C端半段(K172，T175，F176，R178)，而其后段4个氨基酸残基正好位于全长191个氨基酸的生长激素的C-终端附近。因此生长激素C端附近的氨基酸在与受体结合的过程中举足轻重。

换言之，生长激素C端的氨基酸与其功能密切相关，故目前对GH进行基因工程改造时通常避开C端，也不采用人GH的C末端与其他蛋白进行融合的方式。

儿童和成人在生长激素缺乏情况下，补充重组人生长激素(rhGH)是理想的治疗方式。但其缺点是重组人生长激素在人体内药效甚短，其静脉注射的血清清除半衰期约20分钟。若以皮下注射重组人生长激素，其高峰血药浓度通常要几个小时后才能达到，而其消除半衰期则为3至8小时。因此，重组人生长激素的治疗需要每周注射3次，或每天一次，以保持适当的血清生长激素水平。对于那些需要长期接受生长激素治疗的病人，往往由于不能按时注射，造成治疗效果降低。长效、高活性的重组人生长激素因而成为此药剂改善的目标。

在1999年到2004年间，基因技术(Genentech)公司和阿尔凯默斯(Alkermes)股份有限公司开发出Nutropin Depot在市场销售，该产品是一种持续释放形式的生长激素，具长效特性，接受治疗的病人其注射次数可减至每2或4周一次，而不需每天注射。不过由于生产成本过高，该产品在2004年被撤出市场。

在此期间，数种治疗性蛋白药物藉着与某些聚合物如聚乙二醇(PEG)进行结构上的修改来延长半其衰期和改善体内效价而创建了这些蛋白质药物的第二代产品。蛋白药物与聚乙二醇共价性的结合通常可增加蛋白质的有效期限，并降低其在人体内的清除率。重组人生长激素亦不例外。一些有关聚乙二醇生长激素的文献显示，数种不同形式的聚乙二醇生长激素确实具有比重组人生长激素较长的半衰期，但往往在蛋白质的聚乙二醇化过程中造成了生物活性的损失。

IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质。它们的半衰期可高达21天。已有报导将IgG的Fc区域与其它蛋白质(如各种细胞因子和可溶性受体)结合而形成融合蛋白(参见，例如Capon等人，Nature，337：525-531，1989；Chamow等人，Trends Biotechnol.，14：52-60，1996；美国专利No.5,116,964和5,541,087)。典型的融合蛋白是一重二聚体蛋白质，系通过IgG Fc绞链区中的半胱氨酸残基与蛋白连接，而形成类似IgG、但缺少CH1区域和轻链的分子。由于结构上的同源，Fc融合蛋白表现出的体外药物动力学特性与同种型的人IgG相当类似。因此制造含有与人IgG蛋白质的Fc区域相连的hGH融合蛋白，将有助于延长hGH的循环半衰期和/或增加它的生物活性。