[发明专利]一种用斑马鱼定量评价化合物肝毒性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及化合物检测和药物毒性与安全性评价领域，具体涉及一种简单、经济、高通量实现利用斑马鱼幼鱼(larva)定量评价化合物肝毒性的方法。

背景技术

肝脏是体内最大的实质性器官，成人的肝重量约占体重的3％左右。肝脏具有特殊的解剖位置、组织结构与生理生化特性。在机体内肝脏不仅作为人体物质与能量代谢的重要器官。化学物质无论从何种途径进入机体，最终均通过血液循环系统迅速到达肝脏，尤其从消化道吸收的毒性化合物，在进入体循环以前首先与肝脏接触。肝脏作为毒性化合物生物转化的主要器官，在一定条件下，毒性化合物极易对肝脏造成损害作用，特别是经体内代谢增毒的外源化学物质在肝脏代谢转化后其有毒代谢产物可首先损害肝脏。因此肝脏是毒性化合物的重要靶器官[1]。

人类环境中的许多化学物质(包括药物)，在一定剂量水平均可对肝脏造成损害作用。凡是能引起肝脏损害的化学物质均可称为肝毒性化合物。化学毒物引起的肝损伤可以分为急性肝损伤和慢性肝损伤。急性肝损伤一般是短期接触较大剂量肝毒物或者肝脏功能不全时接触某种肝毒物引起病理改变常见肝细胞坏死、脂肪变性、胆汁淤积等。慢性肝损伤可因长期低剂量肝毒物引起，也可由一次急性坏死引起的后遗症，病理改变包括纤维化、硬变、癌变等。

肝毒性是制约化学品开发、生产和应用的重要原因。一项调查显示，84种化合物因为临床毒性而终止进一步药物开发，其中15种(18％)是因为肝毒性。肝毒性也是上市药物因安全问题回收的主要原因。从1961年到1992年，法、德、英和美国共回收181种药物，其中23种是因为肝毒性(13％)[2]。

评价化合物肝毒性的方法有两大类，一类是体外试验，另一类是体内试验。肝毒性的体外试验检测方法有以下几种：①离体肝脏灌流②肝组织切片③离体肝细胞④肝细胞系⑤亚细胞组分⑥遗传工程细胞[3]。体内试验评价采用整体动物试验。最常用的实验动物为大鼠或者小鼠其次为仓鼠、豚鼠、兔、狗等。体内试验的检测方法有以下几类：①血清酶学检测②肝脏排泄功能检测③肝脏化学组成成分改变的检测④肝脏组织病理学检查[1]。

研究表明以上的一些方法虽然是经典的化合物肝毒性评价方法，但有很多的弊端和局限性。体外实验所需费用较低，但缺少了生物整体的循环转换和药物在体内的循环分布，不能真正反映药物的整体生物活性，体内试验通常化合物用量大、实验周期长，操作复杂，价格昂贵，特异性差，而且不可以进行高通量筛选。因此建立一种能很好的模拟毒性化合物在体内的过程，又能快速方便的筛选肝毒性化合物具有重要意义。

斑马鱼是一种新颖的模式生物，越来越广泛的应用于化合物毒性评价实验中。与传统的体内和体外筛选模型相较，活体斑马鱼筛选模型具有诸多优势，克服了原有体外模型在吸收、分布、代谢和排泄环节验证的欠缺及传统体内筛选模型实验周期长、成本高的弊端。与线虫、果蝇相比，斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因高度相似，经英国专家的基因预测发现，斑马鱼的基因与人类基因的相似度高达85％左右，实验结果可比性强。与鼠类等哺乳动物相比，斑马鱼胚胎透明，可同时观察分析多个器官，实验周期短，样本容量大，结果可信度高，所需费用低[4]。更重要的是，斑马鱼具有与生俱来的优点[4，5]：1)饲养成本低，性成熟周期短；2)繁殖能力强，一尾雌鱼每次可产200～300枚卵；3)生长发育速度快，在受精24h后，斑马鱼主要的组织器官原基已形成，可为研究提供大量的样本和较短的实验周期；4)胚胎及幼鱼透明，体外受精，体外发育，可直接观察，并可同时分析多个器官系统；5)胚胎有可以提供营养的卵黄，第一周内不需喂食，可避免化合物处理时化合物与食物成份的相互作用；6)胚胎很小，幼鱼体长只有1-4mm，能够在一个标准的6、12、24、48或96孔板内进行分析；7)给药方式简单：溶于水的小分子物质可直接经皮肤、鳃及消化系统进入斑马鱼体内；不溶于水的物质、大分子物质及蛋白质可进行显微注射。因此斑马鱼可作为很好的化合物肝毒性的研究材料。