[发明专利]一种表达重组人凝血因子Ⅶ的方法及其专用载体

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域中蛋白的重组表达方法，特别是涉及一种高效表达重组人凝血因子VII的方法及其专用载体。

背景技术

凝血过程是机体的重要保护机制之一，是一系列凝血因子相继酶解激活的过程，最终结果是凝血酶和纤维蛋白凝块的形成。这一过程包括内源性凝血途径和外源性凝血途径，这两条途径的主要区别是启动方式和参加的凝血因子不完全相同，但参与两条凝血途径的某些凝血因子能够相互激活，将两条途径联系起来。其中，凝血因子VII发挥了重要作用。

凝血因子VII(coagulation factor VII，FVII)是形成凝血块起始的关键分子之一，在凝血过程中发挥着极其重要的作用。它主要通过与暴露的组织因子(tissue factor，TF)结合，形成TF-FVII复合物而启动外源性凝血途径，同时对内源性凝血途径的启动也具有特殊的调控作用。

人FVII主要由肝脏合成，是一种维生素K依赖的单链糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶家族成员。其基因含9个外显子，全长12.8kb，定位于染色体13q34。人FVII的cDNA(GenBank号：NM 019616)由1335bp组成，编码406个氨基酸残基，分子量约为45.5kDa，经过翻译后修饰，加上侧链的糖基，分子量可达50kDa。

人血浆中FVII主要以酶原形式存在，而活性形式的FVII含量仅占约1％。当FVII的Arg152-Ile153之间的肽键裂解后，由单肽链形式转变为双肽链形式，即形成有酶活性的FVIIa。其中1-152位的氨基酸残基组成FVIIa的轻链，分子量为20kDa；153-406位的残基组成FVIIa的重链，分子量为30kDa。轻链与重链由原第135位和262位氨基酸残基之间的单个二硫键连接。轻链始端约38个氨基酸残基构成γ-羧基谷氨酸区，亦称“Gla”区，其后有两段氨基酸残基的排列顺序与上皮生长因子相似的区域，称为“EGF”区；重链部分氨基酸残基的排列顺序与丝氨酸蛋白酶家族有显著同源性，是FVIIa具有催化作用的功能区，称为丝氨酸蛋白酶区。

FVII在合成过程中所经历的翻译后修饰包括：Asn145和Asn322的N-糖基化，Ser52和Ser60的0-糖基化以及Gla区内多处谷氨酸残基(第6、7、14、16、19、20、25、26、29、35位)的γ-羧基化。

在正常生理条件下，人体内只有大约1％的FVII具有酶活性，而血浆中FVII的水平非常的低，应用放免法测定大约为200-400ng/mL，而且随个体和人种有比较大的波动。人FVII的半衰期非常短，GE Rivard等(Rivard GE，Kovac I，Kunschak M，et al.Clinical study of recovery and half-life of vapor-heated factor VII concentrate.Transfusion.1994，34(11)：975-981.)证明FVII在血浆中的半衰期大约在5小时到7小时之间。

重组人凝血因子VII是指应用基因工程的方法将人FVII的cDNA基因导入哺乳动物细胞中进行体外表达，从而获得重组凝血因子VII。