[发明专利]ZnSe量子点标记牛血清蛋白荧光探针的制备方法

说明书

技术领域  

本发明涉及量子点的生物应用技术领域，更具体涉及一种ZnSe量子点标记牛血清蛋白荧光探针的制备方法，该探针可用于检测污染物、毒物及与蛋白质的作用效应。

背景技术  

有机相合成的量子点不具备亲水性，因此不能直接应用于生物体系，必须对其进行表面修饰，其操作过程复杂，条件要求高。水相合成法制备的量子点能够直接用于生物探针，对其研究愈来愈受到重视，有关这方面的研究进展很快。但由于水相合成的量子点所选用的配体多为简单的巯基化合物，表面的活性基团比较少且表面积很小，难以与目标物质结合，因此水相量子点的直接应用存在局限性。因此，将量子点与生物大分子结合既增大了量子点的表面积，又增加了量子点表面活性基团，克服了水相量子点的应用局限性。

发明内容  

本发明的目的是在于提供了一种ZnSe量子点标记牛血清蛋白荧光探针的制备方法，方法易行，操作方便，快速简单，工艺参数易控制。该探针水溶性和生物相容性好，检测功能应用广泛，性价比高，牛血清蛋白(BSA)很好的修饰了量子点表面，使其具有更高的荧光强度。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

其技术构思是：一种ZnSe量子点标记牛血清蛋白荧光探针，它包括ZnSe量子点(自制，请见A~E步骤)、牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin 简称BSA，＞99% 武汉天源生物技术有限公司)、乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydroehloide 简称EDC，99% 上海共价化学)；2-巯基乙醇(化学纯，中国医药集团上海化学试剂公司)；其余为Tris缓冲溶液。

所述的ZnSe量子点中，醋酸锌(Zn(Ac)₂·2H₂O，上海美兴化工有限公司)、硒氢化钾(KH₄Se，请见A，B步骤)、还原型谷胱甘肽(GSH， Japan)的摩尔比率分别为 1：1/15~1/10：1.6~1.8，95℃条件下加热45~60min。

所述的Tris缓冲溶液pH值为6.8-7.6。

一种ZnSe量子点标记牛血清蛋白荧光探针的制备方法，其步骤如下：

A、            制备硒氢化钾(KH₄Se) 溶液：通过硼氢化钾(KBH₄，天津市天大化学试剂厂)还原硒粉(Se，天津市科密欧化学试剂开发中心)制备，反应方程式如下：

       4KBH₄ + 2Se + 7H₂O → 2KH₄Se + K₂B₄O₇ +11H₂↑

B、 分别称取0.03006g硼氢化钾和0.00789g硒粉于具塞试管中，向其中加入2mL高纯水，塞上塞子，于1~5℃下反应0.5~1.5h，得无色透明液体，为0.05mol/L的硒氢化钾；

C、分别称取0.10975~0.16463g醋酸锌晶体和0.24586~0.41489g还原型谷胱甘肽，溶解于200mL无氧高纯水中；

D、在150~300转/min的搅拌和不断通入高纯氩气的条件下，加入1mL0.05mol/L的硒氢化钾，用5mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH值为10-11，待其混合，得到一种混合液；

E、将步骤D的混合液以每罐50ml分装于聚四氟乙烯消解罐中，于93-97℃下微波加热60~75min，KH₄Se、Zn(Ac)₂·2H₂O，还原型谷胱甘肽的摩尔比率分别为 1/15~1/10：1：1.6~1.8。

F、取E步骤1mL制备好的浓度为1 mmol/L ZnSe量子点，1ml配制好的1×10^-5mol/L的牛血清蛋白溶液，再加入0.2mL0.24g/L的乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐于40℃恒温振荡1-1.5h，使ZnSe量子点通过偶联剂乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐与牛血清蛋白溶液进行充分反应，加入0.3mL、0.1mol/L的2-巯基乙醇终止交联，制得量子点标记牛血清蛋白荧光探针。该探针将牛血清蛋白很好的修饰到了量子点表面，使量子点的荧光强度得到了很大的提高。

所述的ZnSe量子点如何制备的过程请见步骤A~E。