[发明专利]以幼叶为外植体花生再生体系的建立方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及以幼叶为外植体花生再生体系的建立方法。

背景技术

花生是世界重要的油料作物之一，我国的花生产量居世界首位。一些生物及非生物胁迫都会影响花生的产量，尤其是地下害虫、真菌及细菌病害。尽管传统的杂交育种可以得到一些抗虫抗病的品系(Garcia et al.，2006)，但是花生栽培品种遗传多样性低(Kochert et al.，1991)，杂交育种周期长，育成的抗病性状通常与其他非预期的性状连锁，因此，目前通过分子育种手段培育花生品种，改良花生品质具有明显的优势。

再生体系的效率是基因转化成功与否的关键，植物再生体系就是利用细胞的全能性，通过组织培养途径或其他非组织培养途径，在外源激素的作用下经过器官发生或胚体细胞高效、稳定地得到再生植株。外植体的选择要求有较强的再生能力、对抗生素敏感、适宜外源基因的导入及整合。花生的组织培养开始于20世纪40年代，我国则起始于70年代，但再生效率很低。建立一个高效的花生再生体系，对改良花生品质、提高花生产量具有重要的意义。

发明内容

针对上述领域中的缺陷，本发明提供一种以幼叶为外植体花生再生体系的建立方法，该方法的芽诱导率能达到40％左右，芽伸长率达79％，继代生长良好，可成为基因转化的良好的再生体系。

以幼叶为外植体花生再生体系的建立方法，包括如下步骤：

(1)选取幼嫩的叶片，剪去叶缘后，正面朝上放置在含有TDZ和NAA的芽诱导培养基上光照培养出芽，TDZ的浓度为0-1mgl^-1；NAA的浓度为0.5-2mgl^-1，所述TDZ的浓度不高于NAA的浓度，且NAA的浓度与TDZ的浓度差值不大于1mgl^-1；

(2)将产生的不定芽继代，转移到含有6-BA和NAA的伸长培养基上，诱导芽伸长至2cm；6-BA的浓度为4-8mgl^-1，NAA的浓度为0.5-1mgl^-1；

(3)将伸长的不定芽转到含有NAA的生根培养基上培养生根，NAA的浓度为0.5-1mgl^-1；

(4)生根小苗按常规方法移植栽培。

所述芽诱导培养基为MS基础培养基。

所述芽诱导培养基的TDZ的浓度为0.5mgl^-1；NAA的浓度为0.5mgl^-1，步骤(1)培养时间为五周。

所述伸长培养基为MS基础培养基。

所述伸长培养基的6-BA的浓度为8mgl^-1，NAA的浓度为0.5mgl^-1，步骤(2)培养时间为两周。

所述生根培养基为MS基础培养基。

所述生根培养基的NAA的浓度为0.5mgl^-1，步骤(3)培养时间为两周。

所述幼叶为完整胚的子叶在基本培养基上培养5天后长出的幼嫩叶片。

所述完整胚的子叶在培养前需对花生作无菌处理。

所述无菌处理的方法为：花生去壳，放置于75％乙醇中1min，弃乙醇，0.1％升汞中放置4min，灭菌水洗3次，放置于无菌纸上至晾干。

本发明采用幼叶作为花生再生体系的外植体，在含有TDZ和NAA的芽诱导培养基上诱导出芽后，再在含有6-BA和NAA的伸长培养基上促进不定芽伸长，再于含有NAA的生根培养基上培养生根，得到生根小苗，可以按常规方法移植栽培。本发明建立的再生体系，其芽诱导率高达40％左右，芽伸长率达79％。继代生长良好，可成为基因转化的良好的再生体系。

附图说明

图1以幼叶为外植体的花生组织培养

A：幼叶外植体B：不定芽C：诱导芽D：芽伸长E：生根F：移栽及结实

具体实施方式

芽诱导培养基为MS基础培养基，TDZ(即噻苯隆)的浓度为0-1mgl^-1；NAA(即萘乙酸)的浓度为0.5-2mgl^-1

伸长培养基为MS基础培养基，6-BA(即6-苄氨基嘌呤)的浓度为4-8mgl^-1，NAA的浓度为0.5-1mgl^-1；

生根培养基为MS基础培养基，NAA的浓度为0.5-1mgl^-1

MS基础培养基可以市售，也可按配方自行配制。

花生为市售的任一品种。