[发明专利]新型重组双功能融合蛋白及其制法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域。更具体地，本发明涉及新型重组双功能融合蛋白及其制法和用途。本发明还涉及一种生产新型重组双功能融合蛋白药的基因工程技术平台及其应用。

背景技术

肿瘤、肝纤维化、风湿病、艾滋病等每年夺走几千万人的生命，造成数亿美元的经济损失。细胞膜表面的受体和相应配体的结合，是此类疾病产生和发展的重要原因，因此开发相应的蛋白配体药物具有良好的应用前景。

目前公知的蛋白药包括生长因子、激素类蛋白、酶类蛋白、细胞因子、干扰素、促红细胞生成素、以及融合蛋白等。除融合蛋白以外，其它蛋白药均属于均质蛋白，即只含有一种蛋白成分。而现有的融合蛋白药(如依那西普Etanercept、列洛西普rilonacept)由受体蛋白的膜外区与人IgG Fc段融合而成，虽然含有两种蛋白成分，但仍然只发挥一种功能，即阻断细胞膜内源性受体与相应配体的结合。如依那西普可以阻断肿瘤坏死因子(TNF-α)与二型肿瘤坏死因子受体(TNFRII)结合，从而发挥对类风湿病的治疗作用。列洛西普则可以阻断细胞因子白介素1(IL-1)的生物学活性，用以治疗家族性寒冷型自身炎症综合征和穆-韦(Muckle-Wells)两氏综合征。

然而，迄今为止尚没有重组双功能融合蛋白药治疗此类疾病的报道。因此，开发具有双功能融合蛋白药对延长患者的生存时间、改善患者的生存质量、降低死亡率具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一个基因工程技术平台，利用该平台可生产重组双功能融合蛋白类药物如TβRII-Fc-CLEC2，并阐明其用途。

在本发明的第一方面，提供了一种蛋白单体，所述蛋白单体具有式Ia或式Ib所述结构：

A-B-C    (Ia)，或

C-B-A    (Ib)

其中，

A为I型穿膜蛋白膜外区元件；

B为免疫球蛋白元件；

C为II型穿膜蛋白膜外区元件；

“-”表示连接上述元件的肽键或肽接头。

在另一优选例中。所述的蛋白单体具有选自下组的一个或多个特征：

所述的I型穿膜蛋白选自下组：TGF-βRI、TGF-βRII、SIRP1a、RANK、VEGFR1、VEGFR2、CTLA4或其组合。

在另一优选例中，所述的I型穿膜蛋白具有抑制免疫功能、促进肿瘤细胞的转移和侵袭、促进肿瘤组织的血管发生、促进肿瘤转移等功能。

所述的II型穿膜蛋白选自下组：CLEC-2、DECTIN-1、NKG2D、DC-SIGN、Mincle。

在另一优选例中，所述的II型穿膜蛋白具有激活血小板、促进血小板凝集、促进HIV对树突状细胞(DC)感染等功能。

在另一优选例中，A为TGF-βII型受体(TβRII)膜外区元件。

在另一优选例中，B为人免疫球蛋白IgG1的Fc片段。

在另一优选例中，C为CLEC2膜外区元件。

在另一优选例中，上述的肽接头的长度为1-30个氨基酸，较佳地2-15个氨基酸。

在另一优选例中，所述单体具有以下多种功能：

a)可以同时与两种配体结合；

b)可抑制TGF-β所诱导的Smad2的磷酸化；

c)可抑制单克隆抗体18H5与podoplanin阳性肿瘤细胞的结合；

d)可抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。

在本发明的第二方面，提供了一种双功能蛋白二聚体，所述二聚体由两个本发明第一方面所述的蛋白单体构成。

在另一优选例中，所述二聚体具有式IIa或式IIb所述结构：

其中，

A为I型穿膜蛋白膜外区，

B为免疫球蛋白元件，

C为II型穿膜蛋白膜外区，

“||”表示二硫键。

在本发明的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的蛋白单体。

在本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第三方面所述的多核苷酸。

在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第四方面所述载体或基因组中整合有本发明第三方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞为CHO细胞。

在本发明的第六方面，提供了一种产生融合蛋白的方法，它包括步骤：