[发明专利]心脑血管疾病相关的蛋白标志物的联合检测方法及其诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外诊断检测方法及其诊断试剂盒，特别是涉及心脑血管疾病相关的蛋白标志物的液相芯片联合并行检测方法及其诊断试剂盒。

背景技术

心脑血管疾病是中国城市人口和西方发达国家的主要疾病和主要死亡原因之一，主要包括以冠心病、高血压等为代表的心血管疾病，以及缺血性脑血管病和出血性脑血管病。缺血性脑血管病，又称急性缺血性脑血管综合症(AICS)，包括脑梗死(亦称脑梗塞，CI)和短暂性脑缺血性发作(TIA)；出血性脑血管病包括脑出血和蛛网膜下腔出血。心脑血管疾病相关的蛋白标志物的联合检测已成为心脑血管疾病的危险因素筛查或预测、早期诊断、疾病进程、疗效监测和预后判断的非常重要的指标，而多指标联合并行检测的高通量迅速性、准确性和稳定性就更加至关重要。

近年来研究发现的与心脑血管疾病的发生发展相关的蛋白标志物包括D-二聚体D-D、纤溶酶原激活物抑制物PAI-1、组织型纤溶酶原激活物tPA、瘦素LEP、载脂蛋白B ApoB。

目前，对于心脑血管疾病相关的蛋白标志物的测定已有多种检测方法，包括免疫比浊分析、酶联免疫分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、磁分离酶联免疫分析(EIMA)等。但是这些技术都存在着检测通量的局限性，且操作繁琐、灵敏度较差，不能真正满足临床诊断检测的需要。而固相生物芯片技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐的缺点。

液相芯片(xMAP)又称液态芯片，是一种可广泛应用于蛋白质、基因、受体/配体等多种生物反应的新一代生物芯片技术，主要包括颜色编码的微球(Color-coded Beads)、探针分子、被检测物和报告分子四种成分。在微球的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这两种荧光的比例不同，把球形基质分为100种，可以标记上100种不同的探针分子，能同时对一个样品中多达100种不同的目标分子进行检测。反应过程中，探针和报告分子都分别与目标分子特异性结合。反应结束后，使单个的微球通过检测通道，使用红、绿双色激光同时对微球上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测，可确定所结合的检测物的种类和数量。

本发明基于液相芯片技术的极高通量性、高灵敏度、高特异性、重复性好、操作简便、线性范围宽、检测迅速等突出优点，对心脑血管疾病相关的多种蛋白标志物进行并行检测，能够在临床检测上得到更好的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是提供一种用于心脑血管疾病相关的蛋白标志物的液相芯片联合并行检测方法；

本发明所要解决的技术问题之二是提供一种检测心脑血管疾病相关的蛋白标志物的诊断试剂盒；

本发明所要解决的技术问题之三是提供上述诊断试剂盒的应用。

为解决上述技术问题，本发明的一种心脑血管疾病相关的蛋白标志物的液相芯片联合并行检测方法，包括以下步骤：

(1)将捕获抗体与不同编号的微球(Beads)偶联，形成“捕获抗体-微球”二联复合体，所述的每一种捕获抗体分别抗一种心脑血管疾病相关的蛋白标志物，从而使待测样品中的心脑血管疾病相关的蛋白标志物与捕获抗体形成“心脑血管疾病相关的蛋白标志物-捕获抗体-微球”三联复合体；所述的心脑血管疾病相关的蛋白标志物包含以下标志物的任意一种或任意多种或加上其它标志物的组合：D-D、PAI-1、tPA、LEP、ApoB；即所述的多种蛋白标志物可以是包含D-D、PAI-1、tPA、LEP、ApoB中任意一种、任意两种、任意三种、任意四种、任意五种或加上其它标志物的组合。

(2)将不同的检测抗体进行信号标记，其中所述的每一种检测抗体分别抗一种心脑血管疾病相关的蛋白标志物且对应于捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该蛋白标志物的不同抗原表位；

(3)将步骤(1)形成的三联复合体与步骤(2)中带有信号标记的检测抗体混合，从而形成“信号标记的检测抗体-心脑血管疾病相关的蛋白标志物-捕获抗体-微球”四联复合体；

(4)用液相芯片法(xMAP)检测出四联复合体中不同微球的标记信号，从而确定待检测样品中各种心脑血管疾病相关的蛋白标志物的存在及含量。

步骤(4)中，所述确定待检测样品中各种心脑血管疾病相关的蛋白标志物的含量，其具体方法为：将步骤(4)中测定的可检测标记信号与标准曲线进行比较，从而确定待检测样品中各种心脑血管疾病相关的蛋白标志物的含量。

所述的微球的平均直径可以为5.6μm，该微球是结合了不同荧光染料的聚苯烯微球，即颜色编码微球(Color-coded Beads)。